Альфа-кетоглутарат-зависимые гидроксилазы - Alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases

Альфа-кетоглутарат-зависимые гидроксилазы представляют собой основной класс негемовых белков железа, которые катализируют широкий спектр реакций. Эти реакции включают реакции гидроксилирования, деметилирования, расширения кольца, замыкания кольца и десатурации. Функционально αKG-зависимые гидроксилазы сравнимы с ферментами цитохрома P450 . Оба используют O 2 и восстанавливающие эквиваленты в качестве косубстратов, и оба производят воду.

Биологическая функция

αKG-зависимые гидроксилазы играют разные роли. У микроорганизмов, таких как бактерии, αKG-зависимые диоксигеназы участвуют во многих биосинтетических и метаболических путях; например, в E.coli , , то AlkB фермент связан с ремонтом поврежденной ДНК . У растений αKG-зависимые диоксигеназы участвуют в различных реакциях метаболизма растений. К ним относятся биосинтез флавоноидов и биосинтез этилена. У млекопитающих и людей αKG-зависимая диоксигеназа играет функциональную роль в биосинтезе (например, биосинтезе коллагена и биосинтезе L-карнитина), посттрансляционных модификациях (например, гидроксилировании белка), эпигенетической регуляции (например, деметилирование гистонов и ДНК ), а также в качестве сенсоров энергетический обмен .

Многие αKG-зависимые диоксигеназы также катализируют несвязанный оборот, при котором окислительное декарбоксилирование αKG в сукцинат и диоксид углерода происходит в отсутствие субстрата. Каталитическая активность многих αKG-зависимых диоксигеназ зависит от восстановителей (особенно аскорбата), хотя точная роль не ясна.

Каталитический механизм

αKG-зависимые диоксигеназы катализируют реакции окисления путем включения одного атома кислорода из молекулярного кислорода (O 2 ) в свои субстраты. Это преобразование сопровождается окислением косубстрата αKG до сукцината и диоксида углерода. С помеченным O 2 в качестве субстрата одна метка появляется в сукцинате, а другая - в гидроксилированном субстрате:

R 3 CH + O 2 + - O 2 CC (O) CH 2 CH 2 CO 2 - → R 3 C O H + CO 2 + - O O CCH 2 CH 2 CO 2 -

Первый шаг включает связывание αKG и субстрата с активным сайтом. αKG координируется как бидентатный лиганд для Fe (II), в то время как субстрат удерживается нековалентными силами в непосредственной близости. Впоследствии молекулярный кислород на конце связывается с цис-цис-ферментом двух доноров αKG. Некоординированный конец супероксидного лиганда атакует кетоуглерод, вызывая высвобождение CO 2 и образуя промежуточное соединение Fe (IV) -оксо . Этот центр Fe = O затем насыщает субстрат кислородом по механизму отскока кислорода .

Альтернативные механизмы не получили поддержки.

Консенсусный каталитический механизм суперсемейства αKG-зависимых диоксигеназ.

Структура

Протеин

Все αKG-зависимые диоксигеназы содержат консервативную двухцепочечную β-спиральную складку (DSBH, также известную как купин), которая образована двумя β-листами.

Металлофактор

Активный центр содержит высококонсервативный мотив триады аминокислотных остатков 2-His-1-карбоксилата (HXD / E ... H), в котором каталитически важный Fe (II) удерживается двумя остатками гистидина и одной аспарагиновой кислотой / остаток глутаминовой кислоты. Триада N 2 O связывается с одной стороной центра Fe, оставляя три лабильных сайта на октаэдре для связывания αKG и O 2 . Похожий лицевой Fe-связывающий мотив, но с массивом his-his-his, обнаружен в цистеиндиоксигеназе .

Связывание субстрата и косубстрата

Связывание αKG и субстрата анализировали с помощью рентгеновской кристаллографии, молекулярно-динамических расчетов и ЯМР-спектроскопии. Связывание кетоглутарата наблюдали с использованием ингибиторов ферментов.

Некоторые αKG-зависимые диоксигеназы связывают свой субстрат посредством механизма индуцированной подгонки. Например, значительные структурные изменения белка наблюдались при связывании субстрата изоформы 2 пролилгидроксилазы человека (PHD2), αKG-зависимой диоксигеназы, которая участвует в ощущении кислорода, и изопенициллин-N-синтазы (IPNS), микробной αKG-зависимой диоксигеназы.

Упрощенный вид активного сайта изоформы 2 пролилгидроксилазы (PHD2), αKG-зависимой диоксигеназы человека. Fe (II) координируется двумя имидазолами и одним карбоксилатом, обеспечиваемым белком. Другие лиганды на железе, которые временно заняты αKG и O 2 , опущены для ясности.

Ингибиторы

Учитывая важную биологическую роль, которую играет αKG-зависимая диоксигеназа, были разработаны многие ингибиторы αKG-зависимой диоксигеназы. Ингибиторы, которые регулярно использовались для нацеливания на αKG-зависимую диоксигеназу, включают N-оксалилглицин ( NOG ), пиридин-2,4-дикарбоновую кислоту (2,4-PDCA), 5-карбокси-8-гидроксихинолин, FG-2216 и FG- 4592, которые все были разработаны, имитируют кособстрат αKG и конкурируют против связывания αKG в активном центре фермента Fe (II). Хотя они являются мощными ингибиторами αKG-зависимой диоксигеназы, им не хватает селективности, и поэтому их иногда называют так называемыми ингибиторами «широкого спектра действия». Были также разработаны ингибиторы, которые конкурируют с субстратом, такие как ингибиторы на основе пептидила, нацеленные на домен 2 пролилгидроксилазы человека (PHD2), и милдронат , молекулу лекарственного средства, которое обычно используется в России и Восточной Европе, нацеленного на гамма-бутиробетаиндиоксигеназу . Наконец, поскольку αKG-зависимым диоксигеназам требуется молекулярный кислород в качестве сопутствующего субстрата, также было показано, что газообразные молекулы, такие как монооксид углерода и оксид азота, являются ингибиторами αKG-зависимых диоксигеназ, предположительно, конкурируя с молекулярным кислородом за связывание в ион активного центра Fe (II).

Общие ингибиторы αKG-зависимых диоксигеназ. Они конкурируют с косубстратом αKG за связывание с активным центром Fe (II).

Анализы

Многие анализы были разработаны для изучения αKG-зависимых диоксигеназ, чтобы можно было получить такую ​​информацию, как кинетика фермента, ингибирование фермента и связывание лиганда. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) широко применяется для изучения αKG-зависимых диоксигеназ. Например, были разработаны анализы для изучения связывания лиганда, кинетики фермента, способов ингибирования, а также изменения конформации белка. Также широко применяется масс-спектрометрия. Его можно использовать для характеристики кинетики ферментов, для руководства разработкой ингибиторов ферментов, изучения связывания лигандов и металлов, а также для анализа конформационных изменений белков. Также использовались анализы с использованием спектрофотометрии, например, те, которые измеряют окисление 2OG, образование побочного продукта сукцината или образование продукта. Также применялись другие биофизические методы, включая (но не ограничиваясь ими) изотермическую калориметрию титрования (ITC) и электронный парамагнитный резонанс (EPR). Радиоактивные анализы , которые используют 14 C меченных субстратов были также разработаны и используются. Учитывая, что αKG-зависимые диоксигеназы нуждаются в кислороде для их каталитической активности, также применялся анализ потребления кислорода.

дальнейшее чтение

  • Мартинес, Салетт; Хаузинджер, Роберт П. (2015-08-21). «Каталитические механизмы Fe (II) - и 2-оксоглутарат-зависимых оксигеназ» . Журнал биологической химии . 290 (34): 20702–20711. DOI : 10.1074 / jbc.R115.648691 . ISSN  0021-9258 . PMC  4543632 . PMID  26152721 .
  • Hegg EL, Que L Jr (декабрь 1997 г.). «Лицевая триада 2-His-1-карбоксилата - новый структурный мотив в мононуклеарных негемовых ферментах железа (II)». Евро. J. Biochem . 250 (3): 625–629. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1997.t01-1-00625.x . PMID  9461283 ..
  • Мюллюля Р., Тудерман Л., Кивирикко К.И. (ноябрь 1977 г.). «Механизм пролилгидроксилазной реакции. 2. Кинетический анализ последовательности реакций» . Евро. J. Biochem . 80 (2): 349–357. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1977.tb11889.x . PMID  200425 .
  • Валегард К., Тервисша ван Шелтинга А.С., Дубус А., Рангино Г., Остер Л.М., Хайду Дж., Андерссон И. (январь 2004 г.). «Структурные основы образования цефалоспоринов в мононуклеарном ферменте железа» (PDF) . Nat. Struct. Мол. Биол . 11 (1): 95–101. DOI : 10.1038 / nsmb712 . PMID  14718929 . S2CID  1205987 .
  • Прайс Дж. К., Барр Е. В., Тирупати Б., Боллинджер Дж. М. мл., Кребс С. (июнь 2003 г.). «Первая прямая характеристика промежуточного соединения высоковалентного железа в реакции альфа-кетоглутарат-зависимой диоксигеназы: высокоспиновый комплекс FeIV в таурин / альфа-кетоглутаратдиоксигеназе (TauD) из Escherichia coli». Биохимия . 42 (24): 7497–7508. DOI : 10.1021 / bi030011f . PMID  12809506 .
  • Прошляков Д.А., Хеншоу Т.Ф., Монтероссо Г.Р., Райл М.Дж., Хаусингер Р.П. (февраль 2004 г.). «Прямое обнаружение кислородных промежуточных продуктов в негемовом ферменте Fe таурин / альфа-кетоглутарат диоксигеназе». Варенье. Chem. Soc . 126 (4): 1022–1023. DOI : 10.1021 / ja039113j . PMID  14746461 .
  • Hewitson KS, Granatino N, Welford RW, McDonough MA, Schofield CJ (апрель 2005 г.). «Окисление 2-оксоглутарат оксигеназами: негемные системы железа в катализе и передаче сигналов». Фил. Пер. R. Soc. . 363 (1829): 807–828. Bibcode : 2005RSPTA.363..807H . DOI : 10,1098 / rsta.2004.1540 . PMID  15901537 . S2CID  8568103 .
  • Вик Ч.Р., Ланиг Х., Джегер С.М., Бурцлафф Н., Кларк Т. (ноябрь 2012 г.). «Структурное понимание пролилгидроксилазы PHD2: молекулярная динамика и исследование методом DFT». Евро. J. Inorg. Chem . 2012 (31): 4973–4985. DOI : 10.1002 / ejic.201200391 .

использованная литература