Антиядерное антитело - Anti-nuclear antibody
Антинуклеарные антитела ( ANA , также известные как антинуклеарный фактор или ANF ) представляют собой аутоантитела, которые связываются с содержимым ядра клетки . У нормальных людей иммунная система вырабатывает антитела к чужеродным белкам ( антигенам ), но не к человеческим белкам ( аутоантигенам ). В некоторых случаях вырабатываются антитела к человеческим антигенам.
Есть много подтипов Anas , такие как анти-Ro антитело , анти-LA антитела , анти-Sm антитела , анти-nRNP антитела , анти-SCL-70 антитела , анти-дцДНК антитела , анти-гистоновых антитела , антитела к поровым комплексам ядерных , антицентромерные антитела и анти-sp100 антитела . Каждый из этих подтипов антител связывается с различными белками или белковыми комплексами в ядре. Они обнаруживаются при многих заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания , рак и инфекции , с различной распространенностью антител в зависимости от состояния. Это позволяет использовать АНА для диагностики некоторых аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку , синдром Шегрена , склеродермию , смешанное заболевание соединительной ткани , полимиозит , дерматомиозит , аутоиммунный гепатит и волчанку, вызванную лекарственными препаратами .
Тест ANA обнаруживает аутоантитела, присутствующие в сыворотке крови человека . Обычными тестами, используемыми для обнаружения и количественного определения ANA, являются непрямая иммунофлуоресценция и иммуноферментный анализ (ELISA). При иммунофлуоресценции уровень аутоантител указывается в виде титра . Это самое высокое разведение сыворотки, при котором аутоантитела еще обнаруживаются. Положительные титры аутоантител при разведении, равном или превышающем 1: 160, обычно считаются клинически значимыми. Положительные титры менее 1: 160 присутствуют у 20% здорового населения, особенно у пожилых людей. Хотя положительные титры 1: 160 или выше сильно связаны с аутоиммунными нарушениями, они также обнаруживаются у 5% здоровых людей. Скрининг на аутоантитела полезен при диагностике аутоиммунных заболеваний, а мониторинг уровней помогает предсказать прогрессирование заболевания. Положительный тест ANA редко бывает полезным, если отсутствуют другие клинические или лабораторные данные, подтверждающие диагноз.
Иммунитет и аутоиммунитет
В организме человека есть множество защитных механизмов от болезнетворных микроорганизмов , одним из которых является гуморальный иммунитет . Этот защитный механизм производит антитела (большие гликопротеины ) в ответ на иммунный стимул. Для этого процесса требуется множество клеток иммунной системы, включая лимфоциты ( Т-клетки и В-клетки ) и антигенпрезентирующие клетки . Эти клетки координируют иммунный ответ при обнаружении чужеродных белков ( антигенов ), вырабатывая антитела, которые связываются с этими антигенами. В нормальной физиологии лимфоциты, распознающие человеческие белки ( аутоантигены ), либо подвергаются запрограммированной гибели клеток ( апоптозу ), либо становятся нефункциональными. Такая самотолерантность означает, что лимфоциты не должны вызывать иммунный ответ против клеточных антигенов человека. Однако иногда этот процесс не работает, и вырабатываются антитела против человеческих антигенов, что может привести к аутоиммунному заболеванию.
Подтипы ANA
АНА обнаруживаются при многих заболеваниях, а также у некоторых здоровых людей. Эти расстройства включают: системная красная волчанка (SLE), ревматоидный артрит , синдром Шегрена , склеродермия , полимиозит , дерматомиозит , первичный билиарный цирроз печени , вызванные лекарственными средствами волчанка , аутоиммунный гепатит , рассеянный склероз , дискоидной красной , заболевания щитовидной железы , антифосфолипидный синдром , ювенильный идиопатический артрит , псориатический артрит , ювенильный дерматомиозит , идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура , инфекции и рак . Эти антитела можно подразделить в соответствии с их специфичностью, и каждая подгруппа имеет разную предрасположенность к конкретным расстройствам.
Извлекаемые ядерные антигены
Извлекаемые ядерные антигены (ENA) представляют собой группу аутоантигенов , которые изначально были определены как мишени для антител у людей с аутоиммунными заболеваниями. Их называют ENA, потому что они могут быть извлечены из ядра клетки с помощью физиологического раствора. ENA состоят из рибонуклеопротеинов и негистоновых белков, названных либо по имени донора, предоставившего прототип сыворотки (Sm, Ro, La, Jo), либо по названию болезни, в которой были обнаружены антитела (SS- A, SS-B, Scl-70).
Анти-Ро / СС-А и анти-Ла / СС-Б
Антитела против Ro и против La , также известные как SS-A и SS-B, соответственно, обычно обнаруживаются при первичном синдроме Шегрена , аутоиммунном заболевании, которое поражает экзокринные железы . Присутствие обоих антител обнаруживается при 30–60% синдрома Шегрена, только анти-Ro-антитела обнаруживаются при 50–70% синдрома Шегрена и 30% СКВ с поражением кожи, а антитела против La редко встречаются изолированно. . Антитела против La также обнаруживаются при СКВ; однако обычно также присутствует синдром Шегрена. Антитела Anti-Ro также реже обнаруживаются при других заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания печени, целиакию , аутоиммунные ревматические заболевания, сердечную неонатальную красную волчанку и полимиозит . Во время беременности анти-Ro-антитела могут проникать через плаценту и вызывать сердечную блокаду и неонатальную волчанку у младенцев. При синдроме Шегрена анти-Ro и анти-La антитела коррелируют с ранним началом, увеличением продолжительности заболевания, увеличением околоушных желез , поражением вне желез и инфильтрацией желез лимфоцитами. Антитела Anti-Ro специфичны для компонентов комплекса Ro-RNP, включающего белки и РНК 45 кДа, 52 кДа, 54 кДа и 60 кДа . Связывающий белок 60 кДа ДНК / РНК и регуляторный белок Т-клеток 52 кДа являются наиболее охарактеризованными антигенами анти-Ro антител. В совокупности эти белки являются частью комплекса рибонуклеопротеидов (РНП), который связывается с гиРНК, hY1-hY5. Антиген La представляет собой фактор терминации транскрипции 48 кДа РНК-полимеразы III , который связывается с комплексом Ro-RNP.
Механизм продукции антител при синдроме Шегрена до конца не изучен, но апоптоз (запрограммированная гибель клеток) и молекулярная мимикрия могут играть роль. Антигены Ro и La экспрессируются на поверхности клеток, подвергающихся апоптозу, и могут вызывать воспаление в слюнной железе за счет взаимодействия с клетками иммунной системы. Антитела также могут быть получены с помощью молекулярной мимикрии, когда перекрестно реактивные антитела связываются как с вирусными, так и с человеческими белками. Это может происходить с одним из антигенов, Ro или La, и впоследствии может продуцироваться антитела к другим белкам посредством процесса, известного как распространение эпитопа . Ретровирусный белок gag проявляет сходство с белком La и предлагается в качестве возможного примера молекулярной мимикрии при синдроме Шегрена.
Анти-См
Антитела против Смита (Anti-Sm) являются очень специфическим маркером СКВ. Примерно 99% людей без СКВ не имеют антител к Sm, но только 20% людей с СКВ имеют антитела. Они связаны с поражением центральной нервной системы , заболеванием почек , фиброзом легких и перикардитом при СКВ, но не связаны с активностью заболевания. Антигены антител против Sm являются основными единицами малых ядерных рибонуклеопротеидов (snRNP), обозначаемых от A до G, и будут связываться с snRNP U1, U2, U4, U5 и U6. Чаще всего антитела специфичны для единиц B, B 'и D. Молекулярные и эпидемиологические исследования показывают, что антитела против Sm могут быть индуцированы молекулярной мимикрией, потому что белок демонстрирует некоторое сходство с белками вируса Эпштейна-Барра .
Анти-nRNP / анти-U1-RNP
Антитела против ядерного рибонуклеопротеина (анти-нРНП) , также известные как антитела против U1-РНП, обнаруживаются в 30–40% случаев СКВ. Они часто обнаруживаются с антителами против Sm, но могут быть связаны с различными клиническими ассоциациями. Помимо СКВ, эти антитела сильно связаны со смешанным заболеванием соединительной ткани . Антитела против nRNP распознают ядерные единицы A и C snRNP, и поэтому они в первую очередь связываются с U1-snRNP. Иммунный ответ на РНП может быть вызван представлением ядерных компонентов на клеточной мембране в виде апоптотических пузырьков. Молекулярная мимикрия также была предложена в качестве возможного механизма продукции антител к этим белкам из-за сходства между полипептидами U1-RNP и полипептидами вируса Эпштейна-Барра.
Анти-Scl-70 / анти-топоизомераза I
Антитела против Scl-70 связаны со склеродермией . Чувствительность антител к склеродермии составляет примерно 34%, но выше для случаев с диффузным поражением кожи (40%) и ниже для случаев с ограниченным поражением кожи (10%). Специфичность антител составляет 98% и 99,6% при других ревматических заболеваниях и у здоровых людей соответственно. Помимо склеродермии, эти антитела обнаруживаются примерно у 5% людей с СКВ. Антигенной мишенью анти-SCL-70 антител топоизомеразы I .
Анти-Джо-1
Хотя анти-Jo-1 антитела часто входят в состав ANA, на самом деле они являются антителами к цитоплазматическому белку, гистидил-тРНК-синтетазе - аминоацил-тРНК-синтетазе, необходимой для синтеза тРНК, нагруженной гистидином. Они тесно связаны с полимиозитом и дерматомиозитом и редко встречаются при других заболеваниях соединительной ткани. Около 20–40% случаев полимиозита являются положительными на антитела к Jo-1, и у большинства из них наблюдается интерстициальное заболевание легких, маркеры HLA-DR3 и HLA-DRw52 человеческого лейкоцитарного антигена (HLA); в совокупности известный как синдром Джо-1.
Анти-дцДНК
Антитела против двухцепочечной ДНК (анти-дцДНК) сильно связаны с СКВ. Они являются очень специфическим маркером болезни, при этом некоторые исследования указывают почти на 100%. Данные о чувствительности колеблются от 25 до 85%. Уровни антител против дцДНК, известные как титры, коррелируют с активностью заболевания при СКВ; высокие уровни указывают на более активную волчанку. Наличие антител против дцДНК также связано с волчаночным нефритом, и есть доказательства, что они являются причиной. Некоторые антитела против дцДНК обладают перекрестной реактивностью с другими антигенами, обнаруженными на базальной мембране клубочков (GBM) почек, такими как гепарансульфат , коллаген IV, фибронектин и ламинин . Связывание с этими антигенами в почках может вызвать воспаление и фиксацию комплемента , что приведет к повреждению почек. Было показано, что наличие высокого связывания ДНК и низкого уровня C3 имеет чрезвычайно высокую прогностическую ценность (94%) для диагностики СКВ. Также возможно, что антитела против дцДНК интернализуются клетками, когда они связывают мембранные антигены, а затем отображаются на поверхности клетки. Это может способствовать воспалительной реакции Т-клеток в почках. Важно отметить, что не все антитела против дцДНК связаны с волчаночным нефритом и что другие факторы могут вызывать этот симптом в их отсутствие. Антигеном антител против дцДНК является двухцепочечная ДНК .
Антигистоновые антитела
Антигистоновые антитела обнаруживаются в сыворотке до 75–95% людей с лекарственной волчанкой и 75% людей с идиопатической СКВ. В отличие от антител против дцДНК при СКВ эти антитела не фиксируют комплемент. Хотя они чаще всего встречаются при лекарственной волчанке, они также обнаруживаются в некоторых случаях СКВ, склеродермии , ревматоидного артрита и недифференцированного заболевания соединительной ткани . Известно, что многие лекарства вызывают лекарственную волчанку, и они производят различные антигенные мишени в нуклеосоме, которые часто перекрестно реагируют с несколькими гистоновыми белками и ДНК. Прокаинамид вызывает лекарственную волчанку, которая продуцирует антитела к гистоновому комплексу H2A и H2B.
Анти-gp210 и анти-p62
Как антитела против гликопротеина-210 (анти-gp210), так и против нуклеопорина 62 (анти-p62) являются антителами к компонентам ядерной мембраны и обнаруживаются при первичном билиарном циррозе (ПБЦ). Каждое антитело присутствует примерно в 25–30% ПБЦ. Антигены обоих антител являются составными частями ядерной мембраны . gp210 представляет собой белок 200 кДа, участвующий в закреплении компонентов ядерной поры на ядерной мембране. Антиген p62 представляет собой комплекс ядерных пор 60 кДа.
Антицентромерные антитела
Антицентромерные антитела связаны с ограниченным кожным системным склерозом, также известным как синдром CREST , первичным билиарным циррозом и проксимальной склеродермией. Известно шесть антигенов, все они связаны с центромерой ; CENP-A в CENP-F. CENP-A представляет собой белок, подобный гистону H3 размером 17 кДа . CENP-B представляет собой ДНК-связывающий белок массой 80 кДа, участвующий в свертывании гетерохроматина . CENP-C представляет собой белок 140 кДа, участвующий в сборке кинетохор . CENP-D представляет собой белок 50 кДа с неизвестной функцией, но может быть гомологичным другому белку, участвующему в конденсации хроматина , RCC1 . CENP-E представляет собой белок 312 кДа из семейства моторных белков кинезина . CENP-F представляет собой белок 367 кДа из ядерного матрикса, который ассоциируется с кинетохорой в поздней фазе G2 во время митоза. Антитела CENP-A, B и C встречаются наиболее часто (16–42% системного склероза) и связаны с феноменом Рейно, телеангиэктазиями , поражением легких и ранним началом системного склероза.
Анти-sp100
Антитела против sp100 обнаруживаются примерно в 20–30% случаев первичного билиарного цирроза (ПБЦ). Они обнаруживаются у нескольких людей без ПБЦ и поэтому являются очень специфическим маркером болезни. Антиген sp100 находится внутри ядерных тел; большие белковые комплексы в ядре, которые могут играть роль в росте и дифференцировке клеток.
Анти-PM-Scl
Антитела против PM-Scl обнаруживаются в 50% случаев синдрома перекрытия полимиозита / системного склероза (PM / SSc) . Около 80% людей с антителами, присутствующими в сыворотке крови, страдают этим заболеванием. Присутствие антител связано с ограниченным поражением кожи синдромом перекрытия PM / SSc. Антигенные мишени антител являются компонентами экзосомного комплекса, обрабатывающего РНК, в ядрышке . В этом комплексе десять белков, и антитела к восьми из них обнаруживаются с разной частотой; PM / Scl-100 (70–80%), PM / Scl-75 (46–80%), hRrp4 (50%), hRrp42 (21%), hRrp46 (18%), hCs14 (14%), hRrp41 ( 10%) и hRrp40 (7%).
Антитела анти-DFS70
Антитела против DFS70 образуют плотный мелкий пятнистый узор при непрямой иммунофлуоресценции и обнаруживаются у нормальных людей и в различных условиях, но не связаны с системной аутоиммунной патологией. Следовательно, их можно использовать, чтобы исключить такие состояния у людей с положительной анестезиологической активностью. У значительного числа пациентов диагностируется системная красная волчанка или недифференцированное заболевание соединительной ткани, в основном на основании положительного результата ANA. В случае, если не могут быть обнаружены определенные аутоантитела (например, антитела против ENA), рекомендуется тестирование антител против DFS70 для подтверждения диагноза. Тесты на антитела к DFS70 доступны как тесты с маркировкой CE. До сих пор нет доступных анализов, одобренных FDA.
ANA тест
Наличие ANA в крови может быть подтверждено скрининговым тестом. Хотя существует множество тестов для обнаружения ANA, наиболее распространенными тестами, используемыми для скрининга, являются непрямая иммунофлуоресценция и иммуноферментный анализ (ELISA). После обнаружения ANA определяются различные подтипы.
Непрямая иммунофлуоресценция
Непрямая иммунофлуоресценция - один из наиболее часто используемых тестов на ANA. Обычно клетки HEp-2 используются в качестве субстрата для обнаружения антител в сыворотке крови человека. Предметные стекла микроскопа покрыты клетками HEp-2, и сыворотка инкубируется с клетками. Если указанные и целевые антитела присутствуют, они будут связываться с антигенами на клетках; в случае ANA антитела связываются с ядром. Их можно визуализировать, добавляя флуоресцентно меченные (обычно FITC или родопсин B) антитела против человека, которые связываются с этими антителами. Молекула будет флуоресцировать, когда на нее будет направлен свет определенной длины волны, который можно увидеть под микроскопом. В зависимости от антитела, присутствующего в сыворотке человека, и локализации антигена в клетке, на клетках HEp-2 будут видны различные паттерны флуоресценции. Уровни антител анализируются путем разведения сыворотки крови. Тест ANA считается положительным, если флуоресценция наблюдается при титре 1: 40/1: 80. Более высокие титры более клинически значимы, поскольку низкие положительные результаты (≤1: 160) обнаруживаются почти у 20% здоровых людей, особенно у пожилых людей. Только около 5% здорового населения имеют титры АНА 1: 160 или выше.
HEp-2
Примерно до 1975 года, когда были введены клетки HEp-2, ткань животных использовалась в качестве стандартного субстрата для иммунофлуоресценции. Клетки HEp-2 в настоящее время являются одним из наиболее распространенных субстратов для обнаружения ANA с помощью иммунофлуоресценции.
Первоначально возник штамм карциномы гортани, клеточная линия была загрязнена и замещена клетками HeLa , и теперь ее идентифицировали как фактически клетки HeLa.
Они превосходят ранее используемые ткани животных из-за их большого размера и высокой скорости митоза (деления клеток) в клеточной линии . Это позволяет обнаруживать антитела к митоз-специфическим антигенам, например, центромерным антителам. Они также позволяют идентифицировать антитела против Ro, поскольку для фиксации клеток используется ацетон (другие фиксаторы могут смыть антиген).
На клетках HEp-2 наблюдается множество паттернов окрашивания ядер: гомогенные, пятнистые, ядрышковые, ядерно-мембранные, центромерные, ядерно-точечные и плеоморфные. Гомогенная картина наблюдается при окрашивании конденсированных хромосом и интерфазного хроматина . Этот паттерн связан с антителами против дцДНК , антителами к нуклеосомным компонентам и антигистоновыми антителами. Есть два пестрых рисунка: мелкий и грубый. Мелкий крапчатый узор имеет тонкое ядерное окрашивание с неокрашенным метафазным хроматином, который связан с антителами против Ro и против La. Картина грубого окрашивания имеет грубое зернистое окрашивание ядер, вызванное антителами против U1-RNP и против Sm. Картина окрашивания ядрышек связана со многими антителами, включая анти-Scl-70, анти-PM-Scl, анти-фибрилларин и анти-Th / To. Окрашивание ядерной мембраны проявляется в виде флуоресцентного кольца вокруг ядра клетки и продуцируется антителами против gp210 и p62. Паттерн центромеры показывает множественные ядерные точки в интерфазных и митотических клетках, что соответствует количеству хромосом в клетке. Узоры ядерных точек показывают от 13 до 25 ядерных точек в интерфазных клетках и производятся антителами против sp100 . Плеоморфный паттерн вызывается антителами к ядерному антигену пролиферирующих клеток . Было показано, что непрямая иммунофлуоресценция несколько превосходит ELISA при обнаружении ANA из клеток HEp-2.
Crithidia luciliae
Crithidia luciliae - гемофлагелатные одноклеточные протисты . Они используются в качестве субстрата в иммунофлуоресценции для обнаружения антител против дцДНК. Они обладают органеллой, известной как кинетопласт, которая представляет собой большую митохондрию с сетью взаимосвязанных кольцевых молекул дцДНК. После инкубации с сывороткой, содержащей антитела против дцДНК и флуоресцентно меченые антитела против человека, кинетопласт будет флуоресцировать. Отсутствие других ядерных антигенов в этой органелле означает, что использование C.luciliae в качестве субстрата позволяет проводить специфическое обнаружение антител против дцДНК.
ELISA
В иммуноферментном анализе (ELISA) используются микротитровальные планшеты, покрытые антигеном, для обнаружения ANA. Каждая лунка микротитровального планшета покрыта либо одним антигеном, либо несколькими антигенами для обнаружения специфических антител или для скрининга ANA, соответственно. Антигены либо из клеточных экстрактов, либо из рекомбинантных. Сыворотка крови инкубируется в лунках планшета и промывается. Если присутствуют антитела, связывающиеся с антигеном, они останутся после промывки. Добавляют вторичное антитело против человека, конъюгированное с ферментом, таким как пероксидаза хрена . Ферментативная реакция приведет к изменению цвета раствора, пропорциональному количеству антитела, связанного с антигеном. Существуют значительные различия в обнаружении ANA с помощью иммунофлуоресценции и различных наборов для ELISA, и между ними существует лишь маргинальное согласие. Клиницист должен быть знаком с различиями, чтобы оценить результаты различных анализов.
Чувствительность
В следующей таблице приведена чувствительность различных типов ANA к различным заболеваниям.
| Тип АНА | Целевой антиген | Чувствительность (%) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| СКВ | ЛЕ, индуцированный лекарствами | Диффузный системный склероз | Ограниченная системная склеродермия | Синдром Шегрена | Воспалительная миопатия | MCTD | ||
| Все ANA (по косвенной IF ) |
Разные | 95 | 100 | 80 | 80 | 70 | 40–60 | 95 |
| Анти-дцДНК | ДНК | 60 | - | - | - | 30 | - | - |
| Анти-См | Основные белки мяРНП | 40 | - | - | - | - | - | - |
| Антигистон | Гистоны | 60 | 90 | - | - | - | - | - |
| Анти Scl-70 | Топоизомераза I типа | - | - | 20 | 10 | - | - | - |
| Антицентромера | Центромерные белки | - | - | 30 | 80 | - | - | - |
| СС-А (Ro) | РНП | 40 | - | - | - | 50 | 10 | - |
| СС-Б (Ла) | РНП | 10–15 | - | - | - | 60–90 | - | |
| - = чувствительность менее 5% | ||||||||
Некоторые ANA проявляются при нескольких типах заболеваний, что снижает специфичность теста. Например, было показано, что IgM- ревматоидный фактор (IgM-RF) перекрестно реагирует с ANA, давая ложноположительную иммунофлуоресценцию . Положительные ANA, а также антитела против ДНК были зарегистрированы у пациентов с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы . АНА может иметь положительный результат теста в до 45% людей с аутоиммунными состояниями щитовидной железы или ревматоидным артритом , и до 15% людей с ВИЧ или гепатит С . По данным Lupus Foundation of America , «около 5% населения в целом будет иметь положительный результат ANA. Однако, по крайней мере, 95% людей с положительным результатом ANA не страдают волчанкой. Положительный тест на ANA может иногда проходить в семьях. даже если у членов семьи нет признаков волчанки ». С другой стороны, говорят они, хотя 95% пациентов, у которых на самом деле тест на волчанку положительный на ANA, «только небольшой процент имеет отрицательный результат ANA, и многие из них имеют другие антитела (такие как антифосфолипидные антитела , анти- Ro, анти-SSA) или их ANA, преобразованные из положительного в отрицательный из-за стероидов , цитотоксических препаратов или уремии (почечная недостаточность) ».
История
Клеток Л.Е. была обнаружена в костном мозге в 1948 году Харгрейвс и соавт. В 1957 году Холбороу и др. впервые продемонстрировал ANA с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Это было первым признаком того, что процессы, влияющие на ядро клетки, ответственны за СКВ. В 1959 году было обнаружено, что сыворотка от людей с СКВ содержит антитела, которые осаждаются солевыми экстрактами ядер, известные как экстрагируемые ядерные антигены (ENA). Это привело к характеристике антигенов ENA и соответствующих им антител. Таким образом, антитела против Sm и против РНП были открыты в 1966 и 1971 годах соответственно. В 1970-х годах были открыты антитела против Ro / анти-SS-A и анти-La / анти-SS-B. Антитело Scl-70 было известно как специфическое антитело к склеродермии в 1979 году, однако антиген (топоизомераза-I) не был охарактеризован до 1986 года. Антиген и антитело Jo-1 были охарактеризованы в 1980 году.
Смотрите также
Рекомендации
Внешние ссылки
- Блог аутоиммунитета - сводка HEp-2 ANA
- Антинуклеарные + антитела в медицинских предметных рубриках Национальной медицинской библиотеки США (MeSH)
- Greidinger, Eric L .; Хоффман, Д. О.; Роберт У. (31 января 2003 г.). «Обновление CE [химия | иммунология]: Тестирование на антинуклеарные антитела: методы, показания и интерпретация» . Лабораторная медицина . 34 (2): 113–117. DOI : 10,1309 / VUB90VTPMEWV3W0F .