BRAF (ген) - BRAF (gene)

BRAF
Протеин BRAF PDB 1uwh.png
Доступные конструкции
PDB Ортолог поиск: PDBe RCSB
Идентификаторы
Псевдонимы BRAF , B-RAF1, BRAF1, NS7, RAFB1, B-Raf, протоонкоген B-Raf, серин / треонинкиназа
Внешние идентификаторы OMIM : 164757 MGI : 88190 HomoloGene : 3197 GeneCards : BRAF
Ортологи
Разновидность Человек Мышь
Entrez
Ансамбль
UniProt
RefSeq (мРНК)

NM_004333
NM_001354609
NM_001374244
NM_001374258

NM_139294

RefSeq (белок)

NP_647455

Расположение (UCSC) Chr 7: 140,72 - 140,92 Мб Chr 6: 39,6 - 39,73 Мб
PubMed поиск
Викиданные
Просмотр / редактирование человека Просмотр / редактирование мыши

BRAF - это человеческий ген , кодирующий белок B-Raf. Этот ген также называют протоонкогеном B-Raf и гомологом вирусного онкогена мышиной саркомы v-Raf B , в то время как белок более формально известен как серин / треонин-протеинкиназа B-Raf .

Белок B-Raf участвует в передаче сигналов внутри клеток, которые участвуют в управлении ростом клеток . В 2002 году было показано, что он мутирует при некоторых раковых заболеваниях человека .

Некоторые другие наследственные мутации BRAF вызывают врожденные дефекты.

Были разработаны препараты для лечения рака, вызванного мутациями BRAF . Два из этих препаратов, вемурафениб и дабрафениб , одобрены FDA для лечения меланомы на поздней стадии. Вемурафениб был первым одобренным лекарством, появившимся в результате открытия лекарств на основе фрагментов .

Функция

Обзор путей передачи сигналов, участвующих в апоптозе . Роль белков Raf, таких как B-Raf, указана в центре.

В-Raf является членом Raf киназы семейства роста сигнальной трансдукции протеинкиназ . Этот белок играет роль в регуляции сигнального пути киназы MAP / ERK , который влияет на деление , дифференцировку и секрецию клеток .

Состав

B-Raf представляет собой 766- аминокислотную серин / треонинспецифичную протеинкиназу с регулируемой передачей сигнала . Вообще говоря, он состоит из трех консервативных доменов характеристики Raf семейства киназ : консервативная область 1 (CR1), A Рас - GTP -связывающего саморегулируемого домена, консервативная область 2 (CR2), A серин -Rich шарнирной области и консервативная область 3 (CR3), каталитический протеинкиназа домен , который фосфорилирует с консенсусной последовательностью на белковых субстратах. В своей активной конформации B-Raf образует димеры за счет водородных связей и электростатических взаимодействий своих киназных доменов.

CR1

Консервативная область 1 аутоингибирует киназный домен B-Raf (CR3), так что передача сигналов B-Raf регулируется, а не конститутивно. Остатки 155–227 составляют Ras- связывающий домен (RBD), который связывается с эффекторным доменом Ras-GTP, высвобождая CR1 и останавливая ингибирование киназы. Остаточные 234-280 содержат форбол эфира / ДАГ -связывающего цинкового пальца мотива , который участвует в B-Raf мембраны стыковки после того, как Ras-связывающая.

CR2

Консервированная область 2 (CR2) обеспечивает гибкий линкер, который соединяет CR1 и CR3 и действует как шарнир.

CR3

Рисунок 1: Неактивная конформация домена киназы B-Raf (CR3). С помощью палочек показаны гидрофобные взаимодействия P-петли (оранжевый) с остатками активационной петли (серый), которые стабилизируют конформацию неактивной киназы. F595 (красный) блокирует гидрофобный карман, в котором связывается АТФ-аденин (желтый). D576 (оранжевый) показан как часть каталитического контура (пурпурный). Рисунок изменен из PDB id 1UWH.

Консервативный регион 3 (CR3), остатки 457–717, составляет ферментативный киназный домен B-Raf. Эта в значительной степени консервативная структура является двулопастной, соединенной короткой шарнирной областью. Меньшая N- доля (остатки 457–530) в первую очередь отвечает за связывание АТФ, в то время как большая C- доля (остатки 535–717) связывает субстратные белки. Активный сайт представляет собой щель между двумя долями, а каталитический остаток Asp 576 расположен на С-доле, обращенной внутрь этой щели.

Субрегионы

P-петля

Р-петля В-Raf (остатки 464-471) стабилизирует не подлежащую передаче фосфатные группы АТФ во время фермента АТФ-связывающего. В частности, амиды основной цепи S 467, F 468 и G 469 образуют водородную связь с β-фосфатом АТФ, чтобы закрепить молекулу. Функциональные мотивы B-Raf определяли путем анализа гомологии PKA, проанализированной Хэнксом и Хантером, с доменом киназы B-Raf.

Карман для связывания нуклеотидов

V 471, C 532, W 531, T 529, L 514 и A 481 образуют гидрофобный карман, внутри которого аденин АТФ заякорен посредством притяжения Ван-дер-Ваальса при связывании АТФ.

Каталитическая петля

Остатки 574–581 составляют часть киназного домена, ответственного за поддержку переноса γ-фосфата АТФ на белковый субстрат B-Raf. В частности, D 576 действует как акцептор протонов, чтобы активировать нуклеофильный гидроксильный кислород на остатках серина или треонина субстрата, позволяя протекать реакции переноса фосфата, опосредованной основанием катализа .

Мотив DFG

D594, F595 и G596 составляют мотив, центральный для функции B-Raf как в его неактивном, так и в активном состоянии. В неактивном состоянии F595 занимает карман для связывания нуклеотидов, препятствуя проникновению АТФ и уменьшая вероятность ферментативного катализа. В активном состоянии, D594 хелаты двухвалентного магния катион , который стабилизирует бета- и γ-фосфатные группы АТФ, ориентируя гамма-фосфат для передачи.

Цикл активации

Остатки 596-600 образуют сильные гидрофобные взаимодействия с P-петлей в неактивной конформации киназы, блокируя киназу в ее неактивном состоянии до тех пор, пока петля активации не фосфорилируется, дестабилизируя эти взаимодействия наличием отрицательного заряда. Это вызывает переход киназы в активное состояние. В частности, L597 и V600 петли активации взаимодействуют с G466, F468 и V471 P-петли, чтобы сохранить киназный домен в неактивном состоянии до тех пор, пока он не будет фосфорилирован.

Энзимология

B-Raf представляет собой серин / треонин-специфическую протеинкиназу . По существу, он катализирует фосфорилирование остатков серина и треонина в согласованной последовательности целевых белков под действием АТФ , давая в качестве продуктов АДФ и фосфорилированный белок. Поскольку это строго регулируется трансдукции сигнала киназы B-Raf должны сначала связывают Рас - ГТФ , прежде чем стать активными в качестве фермента. После активации B-Raf, консервативное каталитическое ядро ​​протеинкиназы фосфорилирует белковые субстраты, способствуя нуклеофильной атаке активированного субстрата серина или гидроксильного атома кислорода треонина на γ-фосфатную группу АТФ посредством бимолекулярного нуклеофильного замещения .

Активация

Снятие аутоингибирования CR1

Домен киназы (CR3) киназ Raf человека ингибируется двумя механизмами: аутоингибирование собственным регуляторным Ras - GTP- связывающим доменом CR1 и отсутствие посттрансляционного фосфорилирования ключевых остатков серина и тирозина (S338 и Y341 для c-Raf ) в шарнирной области CR2. Во время активации B-Raf аутоингибиторный домен CR1 белка сначала связывает эффекторный домен Ras-GTP с Ras-связывающим доменом CR1 (RBD), чтобы высвободить домен CR3 киназы, как и другие члены семейства киназ Raf человека . Взаимодействие CR1-Ras позже усиливается за счет связывания богатого цистеином субдомена (CRD) CR1 с Ras и мембранными фосфолипидами . В отличие от A-Raf и C-Raf , которые должны фосфорилироваться по гидроксилсодержащим остаткам CR2, прежде чем полностью высвободить CR1, чтобы стать активным, B-Raf постоянно фосфорилируется на CR2 S445. Это позволяет отрицательно заряженному фосфосерину немедленно отталкивать CR1 посредством стерических и электростатических взаимодействий, когда регуляторный домен не связан, освобождая CR3-киназный домен для взаимодействия с белками-субстратами.

Активация домена CR3

После высвобождения аутоингибиторного регуляторного домена CR1 домен киназы CR3 B-Raf должен измениться на свой АТФ- связывающий активный конформер, прежде чем он сможет катализировать фосфорилирование белка . В неактивной конформации F595 мотива DFG блокирует гидрофобный карман связывания аденина, в то время как остатки петли активации образуют гидрофобные взаимодействия с P-петлей, останавливая доступ АТФ к его сайту связывания. Когда активационная петля фосфорилируется, отрицательный заряд фосфата нестабилен в гидрофобной среде P-петли. В результате петля активации меняет конформацию , вытягиваясь через С-долю киназного домена. В этом процессе он формирует стабилизирующие взаимодействия β-листа с β6 цепью. Между тем, фосфорилированный остаток приближается к K507, образуя стабилизирующий солевой мостик, чтобы зафиксировать петлю активации на месте. Мотив DFG изменяет конформацию с петлей активации, заставляя F595 перемещаться из сайта связывания адениновых нуклеотидов в гидрофобный карман, ограниченный спиралями αC и αE . Вместе DFG и движение петли активации при фосфорилировании открывают сайт связывания АТФ . Поскольку все другие субстрат-связывающие и каталитические домены уже присутствуют, фосфорилирование одной только активационной петли активирует киназный домен B-Raf посредством цепной реакции, которая по существу удаляет крышку с подготовленного другим способом активного сайта.

Механизм катализа

Рисунок 2: Катализируемая основанием нуклеофильная атака остатка серин / треонинового субстрата на γ-фосфатную группу АТФ. Шаг 1: хелатирование вторичного иона магния с помощью N581 и депротонирование субстрата Ser / Thr с помощью D576. Шаг 2: нуклеофильная атака активированного гидроксила субстрата на γ-фосфат АТФ. Шаг 3: комплекс магния разрушается, и D576 депротонируется. Шаг 4: выпуск продукции.

Чтобы эффективно катализировать фосфорилирование белка посредством бимолекулярного замещения остатков серина и треонина на АДФ в качестве уходящей группы , B-Raf должен сначала связать АТФ, а затем стабилизировать переходное состояние по мере переноса γ-фосфата АТФ.

Связывание АТФ

B-Raf связывает АТФ, закрепляя нуклеотид аденина в неполярном кармане (желтый, рис. 1) и ориентируя молекулу посредством водородных связей и электростатических взаимодействий с фосфатными группами. Помимо фосфатного связывания P-петли и мотива DFG, описанного выше, K483 и E501 играют ключевую роль в стабилизации непереносимых фосфатных групп. Положительный заряд первичного амина K483 позволяет ему стабилизировать отрицательный заряд α- и β-фосфатных групп АТФ, когда АТФ связывается. Когда АТФ отсутствует, отрицательный заряд карбоксильной группы E501 уравновешивает этот заряд.

Фосфорилирование

Как только АТФ связывается с доменом киназы B-Raf, D576 каталитической петли активирует гидроксильную группу субстрата, увеличивая ее нуклеофильность, чтобы кинетически управлять реакцией фосфорилирования, в то время как другие остатки каталитической петли стабилизируют переходное состояние (рис. 2). N581 хелатирует двухвалентный катион магния, связанный с АТФ, чтобы помочь сориентировать молекулу для оптимального замещения. K578 нейтрализует отрицательный заряд на γ-фосфатной группе АТФ, так что активированный остаток субстрата ser / thr не будет испытывать такое сильное электрон-электронное отталкивание при атаке фосфата. После переноса фосфатной группы высвобождаются АДФ и новый фосфопротеин.

Ингибиторы

Поскольку конститутивно активные мутанты B-Raf обычно вызывают рак (см. «Клиническая значимость») из-за чрезмерной передачи сигналов клеткам для роста, ингибиторы B-Raf были разработаны как для неактивных, так и для активных конформаций киназного домена в качестве кандидатов для лечения рака.

Сорафениб

Рисунок 3: Домен киназы B-Raf заблокирован в неактивной конформации за счет связанного BAY43-9006. Гидрофобные взаимодействия закрепляют BAY43-9006 в сайте связывания АТФ, в то время как водородная связь группы мочевины улавливает D594 мотива DFG. BAY43-9006 трифторметил фенил кольцо дополнительно запрещает движение ДФГА мотива и активации цикла к активному confermer через стерическую закупорку.

BAY43-9006 ( Сорафениб , Нексавар) - это мутантный ингибитор B-Raf и C-Raf V600E, одобренный FDA для лечения первичного рака печени и почек . Bay43-9006 отключает домен киназы B-Raf , блокируя фермент в его неактивной форме. Ингибитор выполняет это путем блокирования кармана связывания АТФ за счет высокого сродства к киназному домену. Затем он связывает ключевую активационную петлю и остатки мотива DFG, чтобы остановить движение активационной петли и мотива DFG к активной конформации. Наконец, трифторметилфенильный фрагмент стерически блокирует мотив DFG и активный сайт конформации петли активации, делая невозможным сдвиг конформации киназного домена, чтобы стать активным.

Дистальное пиридильное кольцо BAY43-9006 закрепляется в гидрофобном нуклеотид-связывающем кармане N-доли киназы, взаимодействуя с W531, F583 и F595. Гидрофобные взаимодействия с каталитической петлей F583 и мотивом DFG F595 стабилизируют неактивную конформацию этих структур, снижая вероятность активации фермента. Дальнейшее гидрофобное взаимодействие K483, L514 и T529 с центральным фенильным кольцом увеличивает сродство киназного домена к ингибитору. Гидрофобное взаимодействие F595 с центральным кольцом также снижает энергетическую привлекательность переключателя конформации DFG. Наконец, полярные взаимодействия BAY43-9006 с киназным доменом продолжают эту тенденцию увеличения ферментативного сродства к ингибитору и стабилизации остатков DFG в неактивной конформации. Водородные связи E501 и C532 связывают мочевину и пиридильную группу ингибитора соответственно, в то время как карбонил мочевины принимает водородную связь от азота амида основной цепи D594, чтобы закрепить мотив DFG на месте.

Трифторметилфенильный фрагмент закрепляет термодинамическую благоприятность неактивной конформации, когда киназный домен связывается с BAY43-9006, стерически блокируя гидрофобный карман между спиралями αC и αE, в котором будут располагаться мотив DFG и петля активации при перемещении в их положения в активная конформация белка.

Вемурафениб

Рисунок 4: Структуры вемурафениба (справа) и его предшественника, PLX 4720 (слева), двух ингибиторов активной конформации домена киназы B-Raf

PLX4032 ( Vemurafenib ) является V600 мутант ингибитором В-Raf одобрен FDA для лечения поздних стадий меланомы . В отличие от BAY43-9006 , который ингибирует неактивную форму киназного домена, вемурафениб ингибирует активную "DFG-in" форму киназы, прочно закрепляясь в АТФ-связывающем сайте. Ингибируя только активную форму киназы, вемурафениб избирательно подавляет пролиферацию клеток с нерегулируемым B-Raf, обычно тех, которые вызывают рак .

Поскольку вемурафениб отличается от своего предшественника, PLX4720, только фенильным кольцом, добавленным по фармакокинетическим причинам, действие PLX4720 эквивалентно действию вемурафениба. PLX4720 имеет хорошее сродство к АТФ сайта связывания частично потому , что его анкер область, 7-аза индола бициклического , только отличается от природного аденина , который занимает место в двух местах , где атомы азота были заменены углеродом. Это позволяет сохранять сильные межмолекулярные взаимодействия, такие как водородная связь N7 с C532 и водородная связь N1 с Q530. Отличное расположение в гидрофобном кармане, связывающем АТФ (C532, W531, T529, L514, A481), также увеличивает сродство связывания. Водородная связь кетонового линкера с водой и дифторфенил во втором гидрофобном кармане (A481, V482, K483, V471, I527, T529, L514 и F583) способствуют исключительно высокому сродству связывания в целом. Селективное связывание с активным Raf осуществляется концевой пропильной группой, которая связывается с Raf-селективным карманом, созданным смещением спирали αC. Селективность активной конформации киназы дополнительно повышается за счет pH-чувствительной депротонированной сульфонамидной группы, которая стабилизируется водородными связями с пептидом основной цепи NH D594 в активном состоянии. В неактивном состоянии сульфонамидная группа ингибитора вместо этого взаимодействует с карбонилом основной цепи этого остатка, создавая отталкивание. Таким образом, вемурафениб связывается преимущественно с активным состоянием киназного домена B-Raf.

Клиническое значение

Мутации в гене BRAF могут вызывать заболевание двумя способами. Во-первых, мутации могут передаваться по наследству и вызывать врожденные дефекты. Во-вторых, мутации могут появиться в более позднем возрасте и вызвать рак в виде онкогена .

Унаследованные мутации в этом гене вызывают кардиофациально-кожный синдром - заболевание, характеризующееся пороками сердца, умственной отсталостью и характерным внешним видом лица.

Мутации в этом гене были обнаружены при раковых заболеваниях, включая неходжкинскую лимфому , колоректальный рак , злокачественную меланому , папиллярную карциному щитовидной железы , немелкоклеточную карциному легких , аденокарциному легких , опухоли головного мозга, включая глиобластому и плеоморфную ксантоастроцитому, а также воспалительную такие заболевания, как болезнь Эрдхейма-Честера .

Мутация V600E гена BRAF была связана с лейкемией волосатых клеток в многочисленных исследованиях и была предложена для использования при скрининге синдрома Линча, чтобы уменьшить количество пациентов, подвергающихся ненужному секвенированию MLH1 .

Мутанты

Выявлено более 30 мутаций гена BRAF , связанных с раком человека. Частота мутаций BRAF широко варьируется при раке человека, от более 80% при меланомах и невусах до всего 0–18% при других опухолях , например, от 1 до 3% при раке легких и 5% при колоректальном раке . В 90% случаев тимин заменяется аденином по нуклеотиду 1799. Это приводит к замене валина (V) на глутамат (E) по кодону 600 (теперь обозначаемому как V600E ) в сегменте активации, который был обнаружен в человеческий рак. Эта мутация широко наблюдалась при папиллярной карциноме щитовидной железы , колоректальном раке, меланоме и немелкоклеточном раке легкого . Мутация BRAF-V600E присутствует у 57% пациентов с гистиоцитозом клеток Лангерганса. Мутация V600E является вероятной драйверной мутацией в 100% случаев лейкемии волосатых клеток . Высокая частота мутаций BRAF V600E была обнаружена в амелобластоме, доброкачественном, но локально инфильтративном одонтогенном новообразовании. Мутация V600E также может быть связана как мутация с одним драйвером (генетический «дымящийся пистолет») с некоторыми случаями развития папиллярной краниофарингиомы .

Другие обнаруженные мутации: R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V5600K, V599V, V599V, V599V и т. д., и большинство этих мутаций сгруппированы в две области: богатая глицином Р-петля N-доли и сегмент активации и фланкирующие области. Эти мутации изменяют активационный сегмент из неактивного состояния в активное состояние, например, в процитированной ранее статье сообщалось, что алифатическая боковая цепь Val599 взаимодействует с фенильным кольцом Phe467 в P-петле. Ожидается, что замена гидрофобной боковой цепи Val среднего размера на более крупный и заряженный остаток, обнаруживаемый при раке человека (Glu, Asp, Lys или Arg), дестабилизирует взаимодействия, которые поддерживают мотив DFG в неактивной конформации, поэтому сегмент активации в активную позицию. В зависимости от типа мутации активность киназы по отношению к MEK также может варьироваться. Большинство мутантов стимулируют повышенную активность киназы B-Raf в отношении MEK. Однако некоторые мутанты действуют посредством другого механизма, потому что, хотя их активность в отношении MEK снижена, они принимают конформацию, которая активирует C-RAF дикого типа, который затем передает сигнал ERK .

BRAF-V600E

  • BRAF V600E определяет чувствительность к ингибиторам протеасом . Уязвимость к ингибиторам протеасом зависит от постоянной передачи сигналов BRAF, поскольку блокада BRAF-V600E с помощью PLX4720 обращает чувствительность к карфилзомибу в клетках мутантного BRAF колоректального рака. Ингибирование протеасом может представлять ценную стратегию нацеливания на мутантные BRAF V600E колоректальные опухоли.

Ингибиторы BRAF

Как упоминалось выше, некоторые фармацевтические фирмы разрабатывают специфические ингибиторы мутированного белка B-raf для противоопухолевого применения, поскольку BRAF является хорошо изученной мишенью с высоким выходом. Вемурафениб (RG7204 или PLX4032) был лицензирован Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США как Zelboraf для лечения метастатической меланомы в августе 2011 года на основании клинических данных фазы III. Было замечено улучшение выживаемости, а также степень ответа на лечение на 53% по сравнению с 7-12% при использовании прежнего лучшего химиотерапевтического лечения дакарбазином . В клинических испытаниях B-Raf увеличивал шансы на выживание пациентов с метастатической меланомой. Несмотря на высокую эффективность препарата, 20% опухолей все еще развивают устойчивость к лечению. У мышей 20% опухолей становятся устойчивыми через 56 дней. Хотя механизмы этой устойчивости все еще обсуждаются, некоторые гипотезы включают сверхэкспрессию B-Raf для компенсации высоких концентраций вемурафениба и восходящую регуляцию передачи сигналов роста.

Более общие ингибиторы B-Raf включают GDC-0879, PLX-4720, сорафениб , дабрафениб и LGX818.

Взаимодействия

Было показано, что BRAF (ген) взаимодействует с:

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки

  • «Ген BRAF» . Словарь терминов по раку NCI . Проверено 25 ноября 2007 .
  • Поиск ошибок в BRAF - сообщение в блоге Cancer Research UK об открытии мутаций BRAF, вызывающих рак (включая видео)
  • Расположение генома человека BRAF и страница сведений о гене BRAF в браузере генома UCSC .

Всеобщее достояние Эта статья включает материалы, являющиеся  общественным достоянием, из документа Национального института рака США: «Словарь терминов по раку» . Эта статья включает текст из Национальной медицинской библиотеки США , который находится в общественном достоянии .