Внеклеточная ДНК плода - Cell-free fetal DNA
Внеклеточная ДНК плода ( вкДНК ) - это ДНК плода, которая свободно циркулирует в материнской крови . Материнская кровь берется путем венепункции . Анализ cffDNA - это метод неинвазивной пренатальной диагностики, который часто назначают беременным женщинам пожилого возраста . Через два часа после родов cffDNA больше не обнаруживается в материнской крови.
Фон
cffDNA происходит из трофобластов плаценты . Фетальной ДНК фрагментируется , когда плацентарные микрочастицы навес в материнской крови циркуляции .
Фрагменты cffDNA составляют приблизительно 200 пар оснований (п.н.) в длину. Они значительно меньше, чем фрагменты материнской ДНК. Разница в размере позволяет отличить cffDNA от фрагментов материнской ДНК.
Примерно от 11 до 13,4 процента внеклеточной ДНК в материнской крови имеет фетальное происхождение. Сумма сильно варьируется от одной беременной женщины к другой. cffDNA присутствует через пять-семь недель беременности. Количество cffDNA увеличивается по мере развития беременности. Количество cffDNA в материнской крови быстро уменьшается после родов. Через два часа после родов cffDNA больше не обнаруживается в материнской крови.
Анализ cffDNA может обеспечить более раннюю диагностику состояний плода, чем современные методы. Поскольку cffDNA обнаруживается в материнской крови, отбор проб не несет сопутствующего риска самопроизвольного аборта . Анализ cffDNA имеет те же этические и практические вопросы, что и другие методы, такие как амниоцентез и взятие проб ворсинок хориона .
Некоторые недостатки отбора образцов cffDNA включают низкую концентрацию cffDNA в материнской крови; различия в количестве cffDNA между людьми; высокая концентрация ДНК, не содержащая материнских клеток, по сравнению с cffDNA в материнской крови.
Новые данные показывают, что частота неудачных тестов cffDNA выше, фракция плода (соотношение ДНК плода по сравнению с материнской ДНК в образце материнской крови) ниже и PPV для трисомий 18, 13 и SCA снижается при беременностях с ЭКО по сравнению с беременностями, зачатыми спонтанно.
Лабораторные методы
Был разработан ряд лабораторных методов для бесклеточного скрининга ДНК плода на генетические дефекты. Основными из них являются (1) массовое параллельное секвенирование дробовиком (MPSS), (2) целевое массовое параллельное секвенирование (t-MPS) и (3) подход, основанный на однонуклеотидном полиморфизме (SNP).
Образец периферической крови матери берут путем венесекции примерно на 10 неделе беременности.
Разделение cffDNA
Плазма крови отделяется от пробы материнской крови с помощью лабораторной центрифуги . Затем cffDNA выделяют и очищают. Стандартизированный протокол для этого был написан на основе оценки научной литературы . Самый высокий выход при экстракции cffDNA был получен с помощью "QIAamp DSP Virus Kit".
Добавление формальдегида к образцам материнской крови увеличивает выход cffDNA. Формальдегид стабилизирует неповрежденные клетки и, следовательно, препятствует дальнейшему высвобождению материнской ДНК. При добавлении формальдегида процентная доля cffDNA, извлеченная из образца материнской крови, колеблется от 0,32 процента до 40 процентов со средним значением 7,7 процента. Без добавления формальдегида средний процент извлеченной кффДНК составил 20,2 процента. Однако другие цифры колеблются от 5 до 96 процентов.
Восстановление cffDNA может быть связано с длиной фрагментов ДНК. Другой способ увеличения ДНК плода основан на физической длине фрагментов ДНК. Более мелкие фрагменты могут составлять до семидесяти процентов от общей внеклеточной ДНК в образце материнской крови.
Анализ cffDNA
В ПЦР в реальном времени флуоресцентные зонды используются для мониторинга накопления ампликонов . Репортерный флуоресцентный сигнал пропорционален количеству генерируемых ампликонов. Наиболее подходящий протокол ПЦР в реальном времени разработан в соответствии с конкретной мутацией или генотипом, который необходимо выявить. Точечные мутации анализируются с помощью качественной ПЦР в реальном времени с использованием аллель- специфичных зондов. инсерции и делеции анализируются путем измерения дозировки с использованием количественной ПЦР в реальном времени.
cffDNA может быть обнаружена путем обнаружения унаследованных от отца последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Количественная ПЦР в реальном времени
Пол определяющая область Y гена (SRY) и короткий тандемный повтор Y хромосомы «DYS14» в cffDNA от 511 беременностей анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). В 401 из 403 беременностей, когда кровь матери была взята на сроке 7 недель или более, были обнаружены оба сегмента ДНК.
Вложенная ПЦР
Использование вложенной полимеразной цепной реакции (вложенная ПЦР) оценивали для определения пола путем обнаружения специфического сигнала Y-хромосомы в cffDNA из материнской плазмы. Вложенная ПЦР выявила 53 из 55 плодов мужского пола. CffDNA из плазмы 3 из 25 женщин с плодом женского пола содержала сигнал, специфичный для Y-хромосомы. Чувствительность вложенных ПЦР в этом эксперименте составл ла 96 процентов. Специфичность была 88 процентов.
Цифровая ПЦР
Микрожидкостные устройства позволяют количественно определять сегменты вкДНК в материнской плазме с точностью, превышающей точность ПЦР в реальном времени. Точечные мутации , потеря гетерозиготности и анеуплоидия могут быть обнаружены за один этап ПЦР. Цифровая ПЦР позволяет мультиплексно дифференцировать плазму крови матери и ДНК плода .
Секвенирование дробовика
Высокопроизводительное секвенирование с использованием таких инструментов, как Solexa или Illumina, дает примерно 5 миллионов тегов последовательности на образец материнской сыворотки. Анеуплоидные беременности, такие как трисомия, были выявлены при тестировании на четырнадцатой неделе беременности. Картирование всего генома плода с помощью анализа родительских гаплотипов было завершено с использованием секвенирования cffDNA из материнской сыворотки. Беременных самок изучали с использованием 2-сплетенного массивно-параллельного секвенирования ДНК материнской плазмы, и трисомия была диагностирована с z-значением больше 3. Секвенирование дало чувствительность 100 процентов, специфичность 97,9 процента, положительную прогностическую ценность 96,6 процента и отрицательную. прогнозная ценность 100 процентов.
Масс-спектрометрии
Матричная лазерная десорбция / ионизация - времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) в сочетании с удлинением на одно основание после ПЦР позволяет обнаруживать cffDNA со специфичностью по одному основанию и чувствительностью к одной молекуле ДНК. ДНК амплифицируется с помощью ПЦР. Затем конструируют линейную амплификацию с реакцией удлинения основания (с третьим праймером) для отжига в области, расположенной выше сайта мутации . К праймеру для удлинения добавляют одно или два основания для получения двух продуктов удлинения из ДНК дикого типа и мутантной ДНК. Одноосновная специфичность обеспечивает преимущества по сравнению с методами на основе гибридизации с использованием зондов гидролиза TaqMan . При оценке техники не было обнаружено ни ложноположительных, ни отрицательных результатов при поиске cffDNA для определения пола плода в шестнадцати образцах материнской плазмы. Пол девяноста одного плода мужского пола был правильно определен с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Техника имела точность, чувствительность и специфичность более 99 процентов.
Эпигенетические модификации
Можно использовать различия в активации генов между ДНК матери и плода. Эпигенетические модификации (наследственные модификации, которые изменяют функцию гена без изменения последовательности ДНК) могут использоваться для обнаружения cffDNA. Гиперметилирован RASSF1 промотор представляет собой универсальный эмбриональной маркер , используемый , чтобы подтвердить наличие cffDNA. Описан метод, в котором cffDNA экстрагировали из материнской плазмы и затем переваривали чувствительными к метилированию и нечувствительными рестрикционными ферментами . Затем был проведен ПЦР-анализ RASSF1A, SRY и DYS14 в реальном времени. В ходе процедуры было обнаружено 79 из 90 (88 процентов) образцов материнской крови, в которых присутствовал гиперметилированный RASSF1A.
мРНК
Транскрипты мРНК генов, экспрессируемых в плаценте, обнаруживаются в материнской плазме. В этой процедуре плазма центрифугируется, поэтому появляется водный слой. Этот слой переносится и из него извлекается РНК . ОТ-ПЦР используется для обнаружения выбранной экспрессии РНК. Например, плацентарный лактоген человека (hPL) и мРНК бета-ХГЧ стабильны в материнской плазме и могут быть обнаружены. (Нг и др., 2002). Это может помочь подтвердить присутствие cffDNA в материнской плазме.
Приложения
Пренатальное распознавание пола
Анализ cffDNA из образца материнской плазмы позволяет пренатально определить пол . Применение пренатального определения пола включает:
- Тестирование на заболевание : мужской или женский пол плода позволяет определить риск конкретного Х-сцепленного рецессивного генетического заболевания при конкретной беременности, особенно если мать является генетическим носителем заболевания.
- Подготовка к любым аспектам воспитания, зависящим от пола.
- Выбор пола , который после доимплантационной генетической диагностики может быть выполнен путем отбора только эмбрионов предпочтительного пола или, после методов постимплантации, путем выполнения аборта с выбором пола в зависимости от результата теста и личных предпочтений.
По сравнению с акушерским ультразвуковым исследованием, которое ненадежно для определения пола в первом триместре, и амниоцентезом, который несет небольшой риск выкидыша , забор материнской плазмы для анализа на cffDNA не представляет риска. Основными мишенями в анализе cffDNA являются ген, ответственный за белок Y области определения пола (SRY) на Y-хромосоме и последовательность DYS14.
Врожденная гиперплазия надпочечников
При врожденной гиперплазии надпочечников в коре надпочечников отсутствует соответствующий синтез кортикостероидов, что приводит к избытку андрогенов надпочечников и поражает плоды женского пола. Происходит внешняя маскулинизация половых органов у плодов женского пола. Матери плодов из группы риска получают дексаметазон на 6 неделе беременности для подавления высвобождения андрогенов гипофизом .
Если в анализе cffDNA, полученном из образца материнской плазмы, отсутствуют генетические маркеры, обнаруженные только на Y-хромосоме, это указывает на плод женского пола. Однако это также может указывать на сбой самого анализа (ложноотрицательный результат). Отцовский генетический полиморфизм и независимые от пола маркеры могут быть использованы для обнаружения cffDNA. Для этого применения должна присутствовать высокая степень гетерозиготности этих маркеров.
Тест на отцовство
Пренатальная ДНК-проверка отцовства коммерчески доступна. Тест можно проводить на девятой неделе беременности.
Заболевания одного гена
Аутосомно-доминантные и рецессивные моногенные расстройства, которые были диагностированы пренатально путем анализа наследуемой отцов ДНК, включают муковисцидоз , бета-талассемию , серповидно-клеточную анемию , спинальную мышечную атрофию и миотоническую дистрофию . Пренатальная диагностика единичных генных заболеваний, вызванных аутосомно-рецессивной мутацией, наследуемой по материнской линии аутосомно-доминантной мутацией или мутациями больших последовательностей, которые включают дупликацию, экспансию или вставку последовательностей ДНК, является более сложной.
В cffDNA труднее обнаружить фрагменты длиной 200-300 п.н., участвующие в нарушениях одного гена.
Например, аутосомно-доминантное заболевание, ахондроплазия , вызывается точечной мутацией гена FGFR3. В двух беременностях с плодом с ахондроплазией была обнаружена отцовская мутация G1138A из cffDNA из образца материнской плазмы в одной и мутация G1138A de novo в другом.
В исследованиях генетики хореи Хантингтона с использованием qRT-PCR cffDNA из образцов материнской плазмы CAG-повторы были обнаружены на нормальном уровне (17, 20 и 24).
cffDNA также может использоваться для диагностики нарушений одного гена . Разработки в лабораторных процессах с использованием cffDNA могут позволить пренатальную диагностику в анеуплоидиях , такие как трисомия 21 (синдром Дауна) у плода.
Гемолитическая болезнь плода и новорожденного
Несовместимость фетальных и материнских антигенов RhD является основной причиной гемолитической болезни новорожденных . Примерно 15 процентов кавказских женщин, 3-5 процентов чернокожих африканских женщин и менее 3 процентов азиатских женщин являются RhD-отрицательными.
Точная пренатальная диагностика важна, потому что заболевание может быть фатальным для новорожденного и потому что матерям из группы риска можно назначать лечение, включая внутримышечный иммуноглобулин (Anti-D) или внутривенный иммуноглобулин .
ПЦР для обнаружения RHD (гена) гена экзоны 5 и 7 из cffDNA , полученной из материнской плазмы от 9 до 13 недель беременности дает высокую степень специфичности, чувствительности и точности диагностики (> 90 процентов) по сравнению с определением RhD от новорожденного пуповинной крови сыворотки . Аналогичные результаты были получены в отношении экзонов 7 и 10. Цифровая капельная ПЦР для определения RhD у плода была сравнима с обычным методом ПЦР в реальном времени.
Регулярное определение статуса RhD у плода с помощью cffDNA в материнской сыворотке позволяет на раннем этапе вести беременность с повышенным риском, снижая при этом ненужное использование Anti-D более чем на 25 процентов.
Анеуплоидия
- Половые хромосомы
Анализ материнской сыворотки cffDNA высокой пропускной последовательности может обнаружить общие плода половых хромосом анеуплоидий , такие как синдром Тернера , синдром Клайнфельтера и тройной X синдром , но процедура в положительное прогностическое значение является низким.
- Трисомия 21
Трисомия плода по 21 хромосоме является причиной синдрома Дауна. Эта трисомия может быть обнаружена путем анализа cffDNA из материнской крови с помощью массового параллельного секвенирования дробовика (MPSS). Другой метод - цифровой анализ выбранных регионов (DANSR). Такие тесты показывают чувствительность около 99% и специфичность более 99,9%. Следовательно, они не могут рассматриваться как диагностические процедуры, но могут использоваться для подтверждения положительного результата скринингового теста матери, такого как скрининг в первом триместре или ультразвуковые маркеры состояния.
- Трисомия 13 и 18
Возможен анализ cffDNA из материнской плазмы с помощью MPSS в поисках трисомии 13 или 18.
Факторы, ограничивающие чувствительность и специфичность, включают уровни cffDNA в материнской плазме; материнские хромосомы могут иметь мозаицизм .
Может быть обнаружен ряд молекул нуклеиновых кислот плода, происходящих из анеуплоидных хромосом, включая мРНК SERPINEB2, оболочку B, гипометилированный SERPINB5 из хромосомы 18, плацентоспецифичный 4 (PLAC4), гиперметилированную синтетазу голокарбоксилазы (HLCS) и мРНК c21orf105 с полной хромосомой 12. трисомия, аллели мРНК в материнской плазме - это не нормальное соотношение 1: 1, а фактически 2: 1. Отношения аллелей, определяемые эпигенетическими маркерами, также можно использовать для обнаружения полных трисомий. Массивное параллельное секвенирование и цифровая ПЦР для обнаружения анеуплоидии плода могут использоваться без ограничения специфическими для плода молекулами нуклеиновых кислот. (MPSS) имеет чувствительность от 96 до 100% и специфичность от 94 до 100% для выявления синдрома Дауна. Его можно проводить на сроке гестации 10 недель . Одно исследование, проведенное в США, оценило уровень ложноположительных результатов в 0,3% и прогностическую ценность положительных результатов в 80% при использовании cffDNA для обнаружения синдрома Дауна.
Преэклампсия
Преэклампсия - сложное состояние беременности, которое обычно проявляется гипертонией и протеинурией после 20 недель беременности. Это связано с плохой цитотрофобластической инвазией миометрия . Начало заболевания на сроке от 20 до 34 недель беременности считается «ранним». Образцы материнской плазмы при беременности, осложненной преэклампсией, имеют значительно более высокие уровни вкДНК, чем при нормальной беременности. Это справедливо для преэклампсии с ранним началом.
Будущие перспективы
Секвенирование нового поколения может быть использовано для получения последовательности полного генома из cffDNA. Это поднимает этические вопросы. Однако полезность процедуры может возрасти по мере обнаружения четких ассоциаций между конкретными генетическими вариантами и болезненными состояниями.