Флуоресценция хлорофилла - Chlorophyll fluorescence

Экстракт хлорофилла в спирте показан под белым светом (вверху) и УФ-светом, вызывающим флуоресценцию (внизу).

Микроскопические изображения листа мха Plagiomnium undulatum . Светлопольная микроскопия вверху и флуоресцентная микроскопия внизу. Красная флуоресценция от хлорофилла в хлоропластах.

Флуоресценция хлорофилла - это свет, повторно излучаемый молекулами хлорофилла во время возврата из возбужденного состояния в невозбужденное . Он используется как индикатор преобразования фотосинтетической энергии у растений , водорослей и бактерий . Возбужденный хлорофилл рассеивает поглощенную световую энергию, стимулируя фотосинтез (фотохимическое преобразование энергии), в виде тепла при нефотохимическом тушении или путем испускания в виде флуоресцентного излучения. Поскольку эти процессы являются взаимодополняющими, анализ флуоресценции хлорофилла является важным инструментом в исследованиях растений с широким спектром применений.

Эффект Каутского

При освещении адаптированного к темноте листа наблюдается быстрое увеличение флуоресценции фотосистемы II (ФСII), за которым следует медленное снижение. Это явление, впервые обнаруженное Каутским и др. В 1932 г. , называется эффектом Каутского. Этот переменный рост флуоресценции хлорофилла происходит из-за фотосистемы II. Флуоресценция фотосистемы I не переменная, а постоянная.

Увеличение флуоресценции происходит из-за того, что реакционные центры ФСII находятся в «закрытом» или химически восстановленном состоянии. Реакционные центры «закрываются», когда не могут принимать дальнейшие электроны. Это происходит, когда акцепторы электронов после ФС II еще не передали свои электроны следующему электронному носителю, поэтому они не могут принять другой электрон. Закрытые реакционные центры снижают общую фотохимическую эффективность и, таким образом, повышают уровень флуоресценции. Перевод листа из темного состояния в светлый увеличивает долю закрытых реакционных центров ФСII, поэтому уровни флуоресценции увеличиваются в течение 1-2 секунд. Впоследствии флуоресценция уменьшается в течение нескольких минут. Это связано с; 1. большее «фотохимическое тушение», при котором электроны транспортируются от ФСII за счет ферментов, участвующих в фиксации углерода; и 2. большее «нефотохимическое тушение», при котором больше энергии преобразуется в тепло.

Измерение флуоресценции

Обычно первоначальным измерением является минимальный уровень флуоресценции . Это флуоресценция в отсутствие фотосинтетического света. ${\ displaystyle \, F_ {0}}$

Чтобы использовать измерения флуоресценции хлорофилла для анализа фотосинтеза, исследователи должны различать фотохимическое тушение и нефотохимическое тушение (рассеивание тепла). Это достигается путем прекращения фотохимии, что позволяет исследователям измерять флуоресценцию только при наличии нефотохимического тушения. Чтобы снизить фотохимическое тушение до незначительного уровня, на лист направляют короткую вспышку света высокой интенсивности. Это временно закрывает все реакционные центры ФСII, что предотвращает передачу энергии ФСII нижележащим электронным носителям. Короткая вспышка не повлияет на нефотохимическое гашение. Во время вспышки флуоресценция достигает уровня, достигаемого при отсутствии какого-либо фотохимического гашения, известного как максимальная флуоресценция . ${\ displaystyle \, F_ {m}}$

Эффективность фотохимического тушения (которая является показателем эффективности ФС II) может быть оценена путем сравнения стабильного выхода флуоресценции на свету и выхода флуоресценции в отсутствие фотосинтетического света . На эффективность нефотохимического тушения влияют различные внутренние и внешние факторы. Изменения в теплоотдаче означают изменения в . Рассеяние тепла не может быть полностью остановлено, поэтому выход флуоресценции хлорофилла в отсутствие нефотохимического тушения не может быть измерен. Поэтому исследователи используют точку, адаптированную к темноте ( ), с которой сравнивают оценки нефотохимического тушения. ${\ displaystyle \, F_ {m}}$${\ displaystyle \, F_ {t}}$${\ displaystyle \, F_ {0}}$${\ displaystyle \, F_ {m}}$${\ displaystyle F_ {m} ^ {0}}$

Общие параметры флуоресценции

${\ displaystyle \, F_ {0}}$: Минимальная флуоресценция (условные единицы). Уровень флуоресценции адаптированного к темноте образца, когда все реакционные центры фотосистемы II открыты.

${\ displaystyle \, F_ {m}}$: Максимальная флуоресценция (условные единицы). Уровень флуоресценции адаптированного к темноте образца при применении импульса высокой интенсивности. Все реакционные центры фотосистемы II закрыты.

${\ displaystyle \, {F_ {0}} '}$: Минимальная флуоресценция (условные единицы). Уровень флуоресценции светоадаптированного образца, когда все реакционные центры фотосистемы II открыты; оно понижается по сравнению с нефотохимическим тушением. ${\ displaystyle \, F_ {0}}$

${\ displaystyle \, {F_ {m}} '}$: Максимальная флуоресценция (условные единицы). Уровень флуоресценции адаптированного к свету образца при применении импульса высокой интенсивности. Все реакционные центры фотосистемы II закрыты.

${\ displaystyle \, F_ {t}}$: Стабильная конечная флуоресценция (условные единицы). Уровень стационарной флуоресценции снижался (= гасился) за счет фотохимических и нефотохимических процессов.

${\ displaystyle \, T_ {1/2}}$: Время половинного нарастания от до . ${\ displaystyle \, F_ {0}}$${\ displaystyle \, F_ {m}}$

Расчетные параметры

${\ displaystyle \, F_ {v}}$переменная флуоресценция. Рассчитывается как = - . ${\ displaystyle \, F_ {v}}$${\ displaystyle \, F_ {m}}$${\ displaystyle \, F_ {0}}$

${\ displaystyle {\ tfrac {F_ {v}} {F_ {m}}}}$- отношение переменной флуоресценции к максимальной флуоресценции. Рассчитывается как . Это показатель максимальной эффективности PSII (эффективность, если бы все центры PSII были открыты). может быть использован для оценки потенциальной эффективности ФСII путем проведения измерений, адаптированных к темноте. ${\ displaystyle {\ frac {F_ {m} -F_ {0}} {F_ {m}}}}$${\ displaystyle {\ tfrac {F_ {v}} {F_ {m}}}}$

${\ displaystyle \, \ Phi _ {PSII}}$измеряет эффективность Фотосистемы II. Рассчитывается как = . Этот параметр измеряет долю света, поглощенного ФСII, который используется в фотохимии. Таким образом, он может дать оценку скорости линейного переноса электронов и, таким образом, указывает на общий фотосинтез. ${\ displaystyle \, Y _ {(II)}}$${\ displaystyle, {\ frac {{F_ {m}} '- F_ {t}} {{F_ {m}}'}}}$

${\ displaystyle \, qP}$(фотохимическая закалка). Рассчитывается как . Этот параметр аппроксимирует долю открытых реакционных центров ФСII. ${\ displaystyle \, {\ frac {{F_ {m}} '- F_ {t}} {{F_ {m}}' - {F_ {0}} '}}}$

Пока дает оценку эффективности и сообщает нам, какие процессы повлияли на эффективность. Закрытие реакционных центров из-за высокой интенсивности света изменит значение . Изменения в эффективности нефотохимического тушения изменят соотношение . ${\ displaystyle \, \ Phi _ {PSII}}$${\ displaystyle \, qP}$${\ displaystyle {\ tfrac {F_ {v}} {F_ {m}}}}$${\ displaystyle \, qP}$${\ displaystyle {\ tfrac {F_ {v}} {F_ {m}}}}$

Приложения теории

Выход ФСII как мера фотосинтеза

Флуоресценция хлорофилла, по-видимому, является мерой фотосинтеза, но это чрезмерное упрощение. Флуоресценция может измерять эффективность фотохимии PSII, которую можно использовать для оценки скорости линейного переноса электронов путем умножения на интенсивность света. Однако исследователи обычно имеют в виду фиксацию углерода, когда говорят о фотосинтезе. Электронный транспорт и фиксация CO ₂ могут хорошо коррелировать, но могут не коррелировать в полевых условиях из-за таких процессов, как фотодыхание, метаболизм азота и реакция Мелера .

Связь транспорта электронов с фиксацией углерода

Мощный метод исследования - одновременное измерение флуоресценции хлорофилла и газообмена для получения полной картины реакции растений на окружающую среду. Один из методов заключается в одновременном измерении фиксации CO ₂ и фотохимии ФСII при разной интенсивности света в условиях, не связанных с фотодыханием. График фиксации CO ₂ и фотохимии PSII показывает потребность в электронах на одну фиксированную молекулу CO ₂ . По этой оценке можно оценить степень фотодыхания . Это было использовано для изучения значения фотодыхания как фотозащитного механизма во время засухи.

Флуоресцентный анализ также может применяться для понимания эффектов низких и высоких температур.

• Sobrado (2008) исследовал газообмен и реакцию флуоресценции хлорофилла А на свет высокой интенсивности у видов-первопроходцев и лесных видов. Полуденный газообмен листьев измеряли с помощью системы фотосинтеза , которая измеряла чистую скорость фотосинтеза, gs и межклеточную концентрацию CO ₂ ( ). В тех же листьях, используемых для измерения газообмена, параметры флуоресценции хлорофилла а (начальная, максимальная, и переменная, ) измеряли с помощью флуорометра. Результаты показали, что, несмотря на то, что виды-первопроходцы и лесные виды, населяющие разные среды обитания, показали одинаковую уязвимость к полуденному фотоингибированию в листьях, подвергшихся воздействию солнца.${\ displaystyle C_ {i}}$${\ displaystyle \, F_ {0}}$${\ displaystyle \, F_ {m}}$${\ displaystyle \, F_ {v}}$

Измерение стресса и стрессоустойчивости

Флуоресценция хлорофилла может измерять большинство типов стресса растений . Флуоресценция хлорофилла может использоваться как показатель стресса растений, поскольку стрессы окружающей среды, например, экстремальные температуры, свет и доступность воды, могут снизить способность растения к нормальному метаболизму. Это может означать дисбаланс между поглощением световой энергии хлорофиллом и использованием энергии в фотосинтезе.

• Favaretto et al. (2010) исследовали адаптацию к сильному свету у пионерных и поздних сукцессионных видов, выращенных при 100% и 10% освещении. Многочисленные параметры, в том числе хлорофилла в флуоресценции, были измерены. Наблюдалось большее снижение яркости при полном солнечном свете у поздних сукцессионных видов, чем у видов-пионеров. В целом, их результаты показывают, что виды-первопроходцы лучше себя чувствуют при ярком солнечном свете, чем виды поздних сукцессий, предполагая, что растения-первопроходцы обладают большей потенциальной устойчивостью к фотоокислительному повреждению.${\ displaystyle {\ tfrac {F_ {v}} {F_ {m}}}}$

• Неоклеус и Василакакис (2009) исследовали реакцию малины на борный и солевой стресс. Флуорометр хлорофилла был использован для измерения , и . На флуоресценцию хлорофилла листьев концентрация NaCl существенно не влияла, когда концентрация B была низкой. Когда B был увеличен, флуоресценция хлорофилла листьев уменьшалась в условиях солевого раствора. Можно сделать вывод, что совместное действие B и NaCl на малину вызывает токсический эффект по фотохимическим параметрам.${\ displaystyle \, F_ {0}}$${\ displaystyle \, F_ {m}}$${\ displaystyle \, F_ {v}}$
• Лу и Чжан (1999) изучали тепловой стресс у растений пшеницы и обнаружили, что температурная стабильность в фотосистеме II листьев, подверженных водному стрессу, положительно коррелирует с сопротивлением метаболизма во время фотосинтеза.

Индекс баланса азота

Пример портативного многопараметрического флуориметра, который использует соотношение между хлорофиллом и флавонолами для определения дефицита азота у растений.

Из-за связи между содержанием хлорофилла и содержанием азота в листьях флуорометры хлорофилла могут использоваться для обнаружения дефицита азота в растениях несколькими методами .

Основываясь на нескольких годах исследований и экспериментов, полифенолы могут быть индикаторами азотного статуса растения. Например, когда растение находится в оптимальных условиях, оно способствует своему первичному метаболизму и синтезирует белки (молекулы азота), содержащие хлорофилл, и небольшое количество флавонолов (вторичные соединения на основе углерода). С другой стороны, в случае нехватки азота мы будем наблюдать повышенное производство флавонолов растением.

NBI (индекс баланса азота) от Force-A позволяет оценить азотные условия культуры путем расчета соотношения между хлорофиллом и флавонолами (в зависимости от распределения азота / углерода).

Измерьте содержание хлорофилла

Гительсон (1999) утверждает: «Было обнаружено, что соотношение между флуоресценцией хлорофилла при 735 нм и диапазоном длин волн от 700 до 710 нм, F735 / F700 линейно пропорционально содержанию хлорофилла (с коэффициентом детерминации r2 более 0,95) и, следовательно, это соотношение можно использовать как точный индикатор содержания хлорофилла в листьях растений ».

Флуорометры хлорофилла

Флуоресцентное изображение (значение Ft) адаксиальной поверхности листа

Развитие флуорометров позволило флуоресцентному анализу хлорофилла стать обычным методом исследования растений. Флуоресцентный анализ хлорофилла произвел революцию в связи с изобретением метода амплитудно-импульсной модуляции (PAM) и появлением первого коммерческого модулированного флуориметра хлорофилла PAM-101 (Walz, Германия). Путем модуляции измерительного светового луча (импульсы микросекундного диапазона) и параллельного обнаружения возбужденной флуоресценции можно определить относительный выход флуоресценции (Ft) в присутствии окружающего света. Что особенно важно, это означает, что флуоресценцию хлорофилла можно измерить в полевых условиях даже при ярком солнечном свете.

Сегодня флуорометры хлорофилла предназначены для измерения множества различных механизмов растений. Протоколы измерений: F _V / F _M и OJIP измеряют эффективность образцов Photosystem II в обычном и известном состоянии адаптации к темноте. Эти протоколы полезны для измерения многих типов стресса растений. Протокол измерения ΔF / F _M ', или Y (II), адаптированный Бернаром Дженти , представляет собой эффективный и чувствительный способ измерения образцов растений в условиях окружающего или искусственного освещения. Однако, поскольку значения Y (II) также изменяются в зависимости от интенсивности света, следует сравнивать образцы при одинаковой интенсивности света, если только световое напряжение не является фокусом измерения. Y (II) может быть более чувствительным к некоторым типам стресса растений, чем F _V / F _M , таким как тепловой стресс.

Также были разработаны другие протоколы измерения механизмов завода. Когда хлоропласт поглощает свет, часть световой энергии идет на фотохимию, часть идет на регулируемое рассеяние тепла, а часть идет на нерегулируемое рассеяние тепла. Существуют различные параметры измерения флуоресценции хлорофилла для измерения всех этих событий. В модели озера q _L измеряет фотохимическое тушение, Y (NYO) измеряет регулируемое рассеяние тепла растениями, а Y (NO) измеряет нерегулируемое рассеяние тепла. Более старый протокол гашения, называемый моделью лужи, использует q _P для фотохимического гашения, q _N для нефотохимического гашения как регулируемого, так и нерегулируемого рассеивания тепла и NPQ для оценки нефотохимического гашения. NPQ также был возрожден в модели озера математически.

Кроме того, параметры q _E и pNPQ были разработаны для измерения фотозащитного цикла ксантофилла. q _T - мера переходов между состояниями. q _M - мера миграции хлоропластов, а q _I - мера фотоингибирования растений.

При более низких уровнях актинической освещенности NPQ = qE + qT + qI

При высоких уровнях актиничного света NPQ = qE + qM = qI

Некоторые флуорометры сконструированы так, чтобы их можно было носить в одной руке.

Последовательное дальнейшее развитие флюорометров для визуализации облегчает визуализацию пространственной неоднородности фотосинтетической активности образцов. Эти неоднородности естественным образом возникают в листьях растений, например, во время роста, различных стрессов окружающей среды или заражения патогенами. Таким образом, знание неоднородностей образцов важно для правильной интерпретации фотосинтетических характеристик образца растений. Высокопроизводительные флуориметрические системы визуализации позволяют анализировать отдельные клетки / отдельные хлоропласты, а также участки образцов, покрывающие целые листья или растения.

Альтернативные подходы

Датчики LIF

Методы, основанные на эффекте Каутского, не исчерпывают всего разнообразия методов обнаружения и оценки, основанных на флуоресценции хлорофилла. В частности, последние достижения в области лазерно-индуцированной флуоресценции (LIF) также предоставляют возможность разработки достаточно компактных и эффективных датчиков для оценки фотофизиологического статуса и биомассы. Вместо измерения эволюции общего потока флуоресценции такие датчики регистрируют спектральную плотность этого потока, возбуждаемого мощными монохроматическими импульсами лазерного света с длительностью наносекунды. Не требуя 15-20-минутного периода адаптации к темноте (как в случае методов эффекта Каутского) и будучи способными возбуждать образец со значительного расстояния, датчики LIF могут обеспечить быструю и удаленную оценку.

• Применение метода LIF для оценки стресса от засухи у пробкового дуба ( Quercus suber ) и морской сосны ( Pinus pinaster ) на основе отношения выбросов хлорофилла I ₆₈₅ / I ₇₄₀ описано в работе. Недавно был использован метод определения LIF для изучения роли белка pPLAIIα в защите фотосинтетического метаболизма во время стресса засухи с использованием генетически модифицированных растений арабидопсиса.

• В 2011 году Vieira et al. применил компактный недорогой датчик LIF (построенный на основе твердотельного лазера Nd: YAG с модуляцией добротности с удвоенной частотой и специально модифицированного коммерческого миниатюрного оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000) для изучения сообществ приливного микрофитобентоса. Эмиссия хлорофилла позволила исследователям адекватно оценить поверхностную биомассу и отследить миграционные ритмы эпипелических бентосных микроводорослей в илистых отложениях.

Смотрите также

• Интегрированный флуориметр для газообмена и флуоресценции хлорофилла листьев
• Нефотохимическое тушение
• Солнечная флуоресценция
• [1]

Усовершенствованный флуориметр хлорофилла с непрерывным возбуждением

Рекомендации

Внешние ссылки

• Лазар (1999). «Индукция флуоресценции хлорофилла А» . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Биоэнергетика . 1412 (1): 1–28. DOI : 10.1016 / s0005-2728 (99) 00047-X . PMID  10354490 .
• Лазар (2006). «Повышение флуоресценции полифазного хлорофилла А измеряется при высокой интенсивности возбуждающего света» . Функциональная биология растений . 33 : 9–30. DOI : 10.1071 / fp05095 .
• Лазар (2015). «Параметры разделения фотосинтетической энергии» . Журнал физиологии растений . 175 : 131–147. DOI : 10.1016 / j.jplph.2014.10.021 . PMID  25569797 .
• Каладжи; и другие. (2012). «Экспериментальные измерения светового излучения растений in vivo: перспектива, посвященная Дэвиду Уокеру». Фотосинтез Исследования . 114 (2): 69–96. DOI : 10.1007 / s11120-012-9780-3 . PMID  23065335 .
• Максвелл, К .; Джонсон, GN (2000). «Флуоресценция хлорофилла - практическое руководство» . Журнал экспериментальной ботаники . 51 (345): 659–68. DOI : 10.1093 / jexbot / 51.345.659 . PMID  10938857 .
• Мурчи и Лоусон (2013). «Флуоресцентный анализ хлорофилла: руководство по передовой практике и пониманию некоторых новых приложений» . Журнал экспериментальной ботаники . 64 (13): 3983–3998. DOI : 10.1093 / JXB / ert208 . PMID  23913954 .