Круговой дихроизм - Circular dichroism

Круговой дихроизм ( ЦД ) - это дихроизм, включающий циркулярно поляризованный свет, то есть дифференциальное поглощение левого и правого света . Левосторонний круговой (LHC) и правосторонний круговой (RHC) поляризованный свет представляют два возможных состояния спинового углового момента для фотона, поэтому круговой дихроизм также называют дихроизмом для спинового углового момента. Это явление было открыто Жан-Батистом Био , Огюстеном Френелем и Эме Коттон в первой половине XIX века. Круговой дихроизм и круговое двулучепреломление являются проявлениями оптической активности . Это проявляется в полосах поглощения в оптически активных хиральных молекул. КД- спектроскопия находит широкое применение во многих различных областях. В частности, УФ- КД используется для исследования вторичной структуры белков. UV / Vis CD используется для исследования переходов с переносом заряда . КД ближнего инфракрасного диапазона используется для исследования геометрической и электронной структуры путем исследования переходов металла dd . Колебательный круговой дихроизм , использующий свет из инфракрасной области энергии, используется для структурных исследований небольших органических молекул, а в последнее время - белков и ДНК.

Физические принципы

Круговая поляризация света

Электромагнитное излучение состоит из электрического и магнитного полей, которые колеблются перпендикулярно друг другу и направлению распространения, то есть поперечной волны . В то время как линейно поляризованный свет возникает, когда вектор электрического поля колеблется только в одной плоскости, свет с круговой поляризацией возникает, когда направление вектора электрического поля вращается вокруг направления его распространения, в то время как вектор сохраняет постоянную величину. В единственной точке пространства вектор с круговой поляризацией будет очерчивать круг в течение одного периода частоты волны, отсюда и название. Две диаграммы ниже показывают векторы электрического поля линейно и циркулярно поляризованного света в один момент времени для диапазона положений; график циркулярно поляризованного электрического вектора образует спираль вдоль направления распространения . Для света с левой круговой поляризацией (LCP), распространяющегося к наблюдателю, электрический вектор вращается против часовой стрелки . Для света с правой круговой поляризацией (RCP) электрический вектор вращается по часовой стрелке.

Линейно pol.png Циркулярно pol.png

Взаимодействие циркулярно поляризованного света с веществом

Когда свет с круговой поляризацией проходит через поглощающую оптически активную среду, скорости между правой и левой поляризациями различаются ( ), а также их длина волны ( ) и степень их поглощения ( ). Круговой дихроизм - вот разница . Электрическое поле светового луча вызывает линейное смещение заряда при взаимодействии с молекулой ( электрический диполь ), тогда как его магнитное поле вызывает циркуляцию заряда ( магнитный диполь ). Эти два движения в сочетании вызывает возбуждение электрона в спиральном движении, которая включает в себя перевод и вращение и связанные с ними оператор . Экспериментально определенная зависимость между вращательной силой образца и величиной

Вращательная сила также была определена теоретически,

Из этих двух уравнений видно, что для того, чтобы иметь ненулевое значение , операторы электрического и магнитного дипольных моментов ( и ) должны преобразовываться как одно и то же неприводимое представление . и являются единственными точечными группами, где это может происходить, делая активными только хиральные молекулы CD.

Проще говоря, поскольку циркулярно поляризованный свет сам по себе является «хиральным», он по-другому взаимодействует с хиральными молекулами . То есть два типа света с круговой поляризацией поглощаются в разной степени. В эксперименте CD равные количества света с левой и правой круговой поляризацией выбранной длины волны поочередно излучаются в (хиральный) образец. Одна из двух поляризаций поглощается больше, чем другая, и эта зависящая от длины волны разность поглощения измеряется, давая спектр КД образца. Из-за взаимодействия с молекулой вектор электрического поля света проходит по эллиптической траектории после прохождения через образец.

Важно, что хиральность молекулы может быть скорее конформационной, чем структурной. То есть, например, белковая молекула со спиральной вторичной структурой может иметь КД, который изменяется при изменении конформации.

Дельта-поглощение

По определению,

где (Delta Absorbance) - это разница между поглощением света с левой круговой поляризацией (LCP) и света с правой круговой поляризацией (RCP) (это то, что обычно измеряется). является функцией длины волны , поэтому для того , чтобы измерение было значимым, должна быть известна длина волны, на которой оно проводилось.

Молярный круговой дихроизм

Это также может быть выражено, применяя закон Бера , как:

куда

и - коэффициенты молярной экстинкции для света LCP и RCP,
это молярная концентрация ,
- длина пути в сантиметрах (см).

потом

молярный круговой дихроизм. Это внутреннее свойство обычно подразумевается под круговым дихроизмом вещества. Поскольку это функция от длины волны, значение молярного кругового дихроизма ( ) должно указывать длину волны, на которой оно действительно.

Внешние эффекты на круговой дихроизм

Во многих практических приложениях кругового дихроизма (КД), как обсуждается ниже, измеренная КД является не просто внутренним свойством молекулы, а скорее зависит от молекулярной конформации. В таком случае CD также может зависеть от температуры, концентрации и химической среды, включая растворители. В этом случае сообщаемое значение CD также должно указывать эти другие релевантные факторы, чтобы быть значимым.

В упорядоченных структурах, лишенных двукратной вращательной симметрии, оптическая активность, включая дифференциальную передачу (и отражение) волн с круговой поляризацией, также зависит от направления распространения через материал. В этом случае так называемая внешняя трехмерная хиральность связана с взаимной ориентацией светового луча и структуры.

Молярная эллиптичность

Хотя обычно измеряется, по историческим причинам большинство измерений указывается в градусах эллиптичности. Молярная эллиптичность - это круговой дихроизм с поправкой на концентрацию. Молярный круговой дихроизм и молярная эллиптичность легко преобразовываются уравнением:

Эллиптический поляризованный свет (фиолетовый) состоит из неравных вкладов правого (синий) и левого (красный) света с круговой поляризацией.

Это соотношение выводится путем определения эллиптичности поляризации как:

куда

и - величины векторов электрического поля света с правой и левой круговой поляризацией соответственно.

Когда равно (когда нет разницы в поглощении света с правой и левой круговой поляризацией), это 0 °, и свет линейно поляризован . Когда любой из или равен нулю (при полном поглощении света с круговой поляризацией в одном направлении), это 45 °, а свет имеет круговую поляризацию .

Как правило, эффект кругового дихроизма невелик, поэтому он мал и может быть приблизительно выражен в радианах . Так как интенсивность или освещенность , , света пропорционален квадрату вектора электрического поля, эллиптичность становится:

Затем, заменив I, используя закон Бера в форме натурального логарифма :

Теперь эллиптичность можно записать как:

Поскольку это выражение можно аппроксимировать, расширив экспоненты в ряду Тейлора до первого порядка, а затем отбросив члены по сравнению с единицей и преобразовав радианы в градусы:

Линейная зависимость концентрации растворенного вещества и длины пути устраняется путем определения молярной эллиптичности как,

Затем, комбинируя последние два выражения с законом Бера , молярная эллиптичность становится:

Единицами молярной эллиптичности являются исторически (град · см 2 / дмоль). Для расчета молярной эллиптичности необходимо знать концентрацию образца (г / л), длину пути ячейки (см) и молекулярную массу (г / моль).

Если образец представляет собой белок, средний вес остатка (средний молекулярный вес аминокислотных остатков, который он содержит) часто используется вместо молекулярного веса, по существу рассматривая белок как раствор аминокислот. Использование средней эллиптичности остатков облегчает сравнение CD белков с разной молекулярной массой; использование этого нормализованного CD важно при изучении структуры белка.

Эллиптичность среднего остатка

Способы оценки вторичной структуры полимеров, белков и, в частности, полипептидов часто требуют преобразования измеренного спектра молярной эллиптичности в нормированное значение, в частности, значение, не зависящее от длины полимера. Для этого используется средняя эллиптичность остатка; это просто измеренная молярная эллиптичность молекулы, деленная на количество мономерных единиц (остатков) в молекуле.

Применение к биологическим молекулам

Верхняя панель: спектроскопия кругового дихроизма в ультрафиолетовом диапазоне длин волн (УФ-КД) слитого белка МВР-цитохром b 6 в различных растворах детергентов. Это показывает, что белок в DM, как и в растворе Triton X-100, восстановил свою структуру. Однако спектры, полученные из раствора SDS, показывают снижение эллиптичности в диапазоне от 200 до 210 нм, что указывает на неполное восстановление вторичной структуры.
Нижняя панель: содержание вторичных структур, предсказанных из спектров КД с использованием алгоритма CDSSTR. Белок в растворе SDS показывает повышенное содержание неупорядоченных структур и пониженное содержание спиралей.

Обычно это явление проявляется в полосах поглощения любой оптически активной молекулы. Как следствие, круговой дихроизм проявляется биологическими молекулами из-за их правовращающих и левовращающих компонентов. Еще более важно то, что вторичная структура также будет сообщать отдельный CD своим соответствующим молекулам. Таким образом, альфа - спираль белков и двойная спираль из нуклеиновых кислот имеют CD - спектральные характеристики репрезентативные их структуры. Способность CD давать репрезентативную структурную сигнатуру делает его мощным инструментом в современной биохимии с приложениями, которые можно найти практически во всех областях исследований.

CD тесно связан с методом оптической вращательной дисперсии (ORD) и обычно считается более продвинутым. CD измеряется в полосах поглощения интересующей молекулы или рядом с ними, в то время как ORD можно измерять вдали от этих полос. Преимущество CD проявляется в анализе данных. Структурные элементы выделяются более четко, поскольку их записанные полосы не перекрываются в значительной степени на определенных длинах волн, как это происходит в ORD. В принципе, эти два спектральных измерения могут быть взаимно преобразованы с помощью интегрального преобразования ( соотношение Крамерса – Кронига ), если в измерения включены все поглощения.

Спектр КД белков в дальнем УФ ( ультрафиолетовом ) диапазоне может выявить важные характеристики их вторичной структуры . Спектры КД можно легко использовать для оценки доли молекулы, которая находится в конформации альфа-спирали, конформации бета-листа, конформации бета-витка или какой-либо другой конформации (например, случайный клубок ). Эти дробные отнесения налагают важные ограничения на возможные вторичные конформации, в которых может находиться белок. CD, как правило, не может сказать, где обнаруженные альфа-спирали расположены внутри молекулы, или даже полностью предсказать их количество. Несмотря на это, CD - ценный инструмент, особенно для демонстрации изменений в экстерьере. Его можно, например, использовать для изучения того, как вторичная структура молекулы изменяется в зависимости от температуры или концентрации денатурирующих агентов, например хлорида гуанидиния или мочевины . Таким образом, он может выявить важную термодинамическую информацию о молекуле (такую ​​как энтальпия и свободная энергия Гиббса денатурации), которую иначе нельзя легко получить. Любой, кто пытается изучить белок, найдет CD ценным инструментом для проверки того, что белок находится в своей нативной конформации, прежде чем проводить с ним обширные и / или дорогостоящие эксперименты. Также существует ряд других применений КД-спектроскопии в химии белков, не связанных с оценкой фракции альфа-спирали. Более того, спектроскопия КД использовалась в исследованиях биоинорганических интерфейсов. В частности, он использовался для анализа различий во вторичной структуре сконструированного белка до и после титрования реагентом.

Спектр КД белков в ближнем УФ-диапазоне (> 250 нм) дает информацию о третичной структуре . Сигналы, полученные в области 250–300 нм, обусловлены поглощением, дипольной ориентацией и природой окружающей среды фенилаланина, тирозина, цистеина (или дисульфидных мостиков SS ) и аминокислот триптофана . В отличие от КД в дальнем УФ, спектр КД в ближнем УФ не может быть отнесен к какой-либо конкретной трехмерной структуре. Скорее, спектры КД в ближнем УФ-диапазоне предоставляют структурную информацию о природе простетических групп в белках, например, гемовых групп в гемоглобине и цитохроме с .

Видимая спектроскопия КД - очень мощный метод изучения взаимодействий металл-белок, позволяющий разрешить отдельные электронные d-d переходы как отдельные полосы. Спектры КД в видимой области света создаются только тогда, когда ион металла находится в хиральном окружении, поэтому свободные ионы металла в растворе не обнаруживаются. Это имеет то преимущество, что позволяет наблюдать только металл, связанный с белком, поэтому легко получить зависимость от pH и стехиометрию. Оптическую активность в комплексах ионов переходных металлов приписывают конфигурационным, конформационным и вицинальным эффектам. Klewpatinond и Viles (2007) разработали набор эмпирических правил для предсказания появления видимых спектров КД для плоско-квадратных комплексов Cu 2+ и Ni 2+, включающих гистидин и координацию основных цепей.

КД дает менее конкретную структурную информацию, чем , например, рентгеновская кристаллография и ЯМР- спектроскопия белков , которые дают данные с атомным разрешением. Однако КД-спектроскопия - это быстрый метод, который не требует большого количества белков или обширной обработки данных. Таким образом, CD можно использовать для исследования большого количества условий растворителя , различной температуры , pH , солености и присутствия различных кофакторов.

КД- спектроскопия обычно используется для изучения белков в растворе и, таким образом, дополняет методы исследования твердого состояния. Это также ограничение, поскольку многие белки встроены в мембраны в своем естественном состоянии, а растворы, содержащие мембранные структуры, часто сильно рассеиваются. CD иногда измеряют в тонких пленках.

КД- спектроскопия также проводилась с использованием полупроводниковых материалов, таких как TiO 2, для получения больших сигналов в УФ-диапазоне длин волн, где часто происходят электронные переходы для биомолекул.

Экспериментальные ограничения

КД также изучался в углеводах , но с ограниченным успехом из-за экспериментальных трудностей, связанных с измерением спектров КД в вакуумной ультрафиолетовой (ВУФ) области спектра (100–200 нм), где лежат соответствующие полосы КД незамещенных углеводов. . Замещенные углеводы с полосами выше VUV-области были успешно измерены.

Измерение CD также осложняется тем фактом, что типичные водные буферные системы часто поглощают в диапазоне, в котором структурные особенности демонстрируют дифференциальное поглощение циркулярно поляризованного света. Фосфатный , сульфатный , карбонатный и ацетатный буферы, как правило, несовместимы с ЦД, если они не являются чрезвычайно разбавленными, например, в диапазоне 10–50 мМ. Следует полностью избегать использования буферной системы TRIS при выполнении CD вдали от ультрафиолета. Боратов и ониевая соединения часто используются , чтобы установить соответствующий диапазон рН для экспериментов CD. Некоторые экспериментаторы заменили хлорид-ион фторидом, потому что фторид меньше поглощает в далеком УФ, а некоторые работали в чистой воде. Другой, почти универсальный метод состоит в том, чтобы минимизировать поглощение растворителя за счет использования ячеек с меньшей длиной пути при работе в дальнем УФ-диапазоне, длина пути 0,1 мм не является редкостью в этой работе.

Помимо измерения в водных системах, CD, особенно в дальнем УФ-диапазоне, можно измерить в органических растворителях, например этаноле, метаноле, трифторэтаноле (TFE). Последний имеет то преимущество, что вызывает формирование структуры белков, индуцируя бета-листы в одних и альфа-спирали в других, которые они не проявляют в нормальных водных условиях. Однако наиболее распространенные органические растворители, такие как ацетонитрил , ТГФ , хлороформ , дихлорметан , несовместимы с КД в дальнем УФ-диапазоне.

Может быть интересно отметить, что спектры КД белков, используемые для оценки вторичной структуры, связаны с орбитальным поглощением от π до π * амидных связей, связывающих аминокислоты. Эти полосы поглощения частично лежат в так называемом вакуумном ультрафиолете (длины волн менее примерно 200 нм). Интересующий диапазон длин волн фактически недоступен в воздухе из-за сильного поглощения света кислородом на этих длинах волн. На практике эти спектры измеряются не в вакууме, а в бескислородном приборе (заполненном чистым газом азота ).

После удаления кислорода, возможно, вторым наиболее важным техническим фактором при работе на глубине менее 200 нм является проектирование остальной части оптической системы с низкими потерями в этой области. В этом отношении критическим является использование алюминированных зеркал , покрытия которых оптимизированы для низких потерь в этой области спектра.

Обычным источником света в этих приборах является ксеноновая лампа высокого давления с короткой дугой . Обычные ксеноновые дуговые лампы непригодны для использования в условиях слабого УФ-излучения. Вместо этого необходимо использовать специально сконструированные лампы с колбами из синтетического плавленого кварца высокой чистоты .

Свет от синхротронных источников имеет гораздо больший поток на коротких волнах и используется для записи компакт-дисков с длиной волны до 160 нм. В 2010 году спектрофотометр КД в электронном накопителе ISA в Орхусском университете в Дании использовался для записи твердотельных спектров КД до 120 нм. На квантовомеханическом уровне характеристики кругового дихроизма и оптического вращения идентичны. Оптическая вращательная дисперсия и круговой дихроизм имеют одинаковое квантовое информационное содержание.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки