Дегидрогеназа D-аминокислот - D-amino acid dehydrogenase
Дегидрогеназа D-аминокислот (EC 1.4.99.1 ) - это бактериальный фермент, который катализирует окисление D-аминокислот до соответствующих оксокислот . В качестве кофакторов он содержит как флавин, так и негемовое железо . Фермент обладает очень широкой специфичностью и может действовать на большинство D-аминокислот.
D-аминокислота + акцептор H 2 O + <=> 2-оксокислота + восстановленный акцептор NH 3 +
Эта реакция отличается от реакции окисления , катализируемой D-аминокислот оксидазы , что использование кислорода в качестве второй подложки, как дегидрогеназа можно использовать множество различных соединений в качестве акцепторов электронов, с физиологическим субстратом коферментом Q .
Дегидрогеназа D-аминокислот - это фермент, который катализирует НАДФН из НАДФ + и D-глюкозы с образованием D-аминокислот и дегидрогеназы глюкозы. Некоторые, но не ограничиваясь этим, эти аминокислоты - это D-лейцин, D-изолейцин и D-валин, которые являются незаменимыми аминокислотами, которые люди не могут синтезировать из-за того, что они не включены в их рацион. Кроме того, D-аминокислоты катализируют образование 2-оксокислот с образованием D-аминокислот в присутствии DCIP, который является акцептором электронов. D-аминокислоты используются в качестве компонентов фармацевтических продуктов, таких как антибиотики, антикоагулянты и пестициды, поскольку было показано, что они не только более эффективны, чем их L-энантиомеры, но и более устойчивы к разрушению ферментами. Ферменты дегидрогеназы D-аминокислот были синтезированы посредством мутагенеза со способностью продуцировать прямые, разветвленные, циклические алифатические и ароматические D-аминокислоты. Солюбилизированная дегидрогеназа D-аминокислот имеет тенденцию увеличивать свое сродство к D-аланину, D-аспарагину и D- амино-н-бутирату.
У E. coli K12 дегидрогеназа D-аминокислоты наиболее активна с D-аланином в качестве субстрата, поскольку эта аминокислота является единственным источником углерода, азота и энергии. Фермент оптимально работает при pH 8,9 и имеет константу Михаэлиса для D-аланина, равную 30 мМ. DAD, обнаруженный в мембране B грамотрицательной E. coli, также может преобразовывать L-аминокислоты в D-аминокислоты.
Кроме того, дегидрогеназа D-аминокислоты используется в дегидрогеназе, связанной с красителем (Dye-DHs), в которой в качестве акцептора электронов используются искусственные красители, такие как 2,6-дихлориндофенол (DCIP), а не естественные акцепторы электронов. Это может ускорить реакцию между ферментом и субстратом при переносе электронов.
Использование в реакциях синтеза
Дегидрогеназа D-аминокислот показала свою эффективность в синтезе аминокислот с разветвленной цепью, таких как D-лейцин, D-изолейцин и D-валин. В данном исследовании исследователи успешно смогли использовать дегидрогеназу D-аминокислот для создания большого количества этих продуктов из исходного материала 2-оксокислот в присутствии аммиака. Условия для этого были различными, хотя наилучшие результаты были получены при температуре около 65 ° C.
Аминокислоты, полученные в результате этих реакций, привели к высокой энантиоселективности> 99% и высоким выходам> 99%.
Учитывая природу этого фермента, его можно использовать для создания неразветвленных D-аминокислот, а также модифицированных D-аминокислот.
Получение D-аминокислотной дегидрогеназы
В одном исследовании, чтобы проверить жизнеспособность использования D-аминодегидрогеназы в реакциях синтеза, исследователи использовали мутантные бактерии для получения и создания различных штаммов фермента. Эти исследователи обнаружили, что потребовалось всего пять мутаций, чтобы изменить селективную D-амино-дегидрогеназу для работы с другими D-аминокислотами. Они также обнаружили, что он сохраняет свою высокоселективную природу, способную получать в основном D-энантиомеры после мутации с выходами, превышающими 95%.
Термостойкий вариант дегидрогеназы D-аминокислот был обнаружен у бактерии Rhodothermus marinus JCM9785. Этот вариант участвует в катаболизме транс-4-гидрокси-L-пролина.
Из данных исследований, чтобы получить дегидрогеназу D-аминокислоты, необходимо сначала ввести и выразить ее в пределах данного вида бактерий, некоторые из которых упоминались ранее. Затем он должен быть очищен в благоприятных условиях. Они основаны на конкретных видах дегидрогеназы D-аминокислот, используемых в данном исследовательском эксперименте. В неправильных условиях белок может денатурировать. Например, было обнаружено, что именно D-аланиндегидрогеназы из E. coli и P. aeruginosa теряли большую часть своей активности при воздействии условий 37-42 ° C. После этого можно отделить и очистить существующими методами.
Искусственная дегидрогеназа D-аминокислот
Из-за недостатков существующих методов исследователи начали работу по созданию искусственного фермента, способного производить те же D-аминокислоты, что и ферменты из природных источников. Им удалось добавить пять аминокислот к данному образцу, выделенному из U. thermosphaericus. Изменяя аминокислотную последовательность, исследователи смогли изменить специфичность молекулы по отношению к определенным реагентам и продуктам, показав, что можно использовать искусственную дегидрогеназу D-аминокислот для скрининга определенных продуктов D-аминокислот.
