Извлечение ДНК - DNA extraction

Для получения информации о различных методах см. Методы с использованием нуклеиновых кислот .

Первое выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) было сделано в 1869 году Фридрихом Мишером . В настоящее время это обычная процедура в молекулярной биологии или судебно-медицинской экспертизе . Для химического метода существует множество различных наборов, используемых для экстракции, и выбор правильного поможет сэкономить время на оптимизации набора и процедурах экстракции. Считается, что определение чувствительности ПЦР показывает различия между коммерческими наборами.

Основная процедура

Клеточные и гистоновые белки, связанные с ДНК, можно удалить либо добавлением протеазы, либо осаждением белков ацетатом натрия или аммония , либо их экстракцией смесью фенол-хлороформ перед осаждением ДНК.

После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в буфере ТЕ или в сверхчистой воде .

Выбор метода

Некоторые из наиболее распространенных методов экстракции ДНК включают органическую экстракцию , экстракцию Chelex и твердофазную экстракцию . Эти методы постоянно дают изолированную ДНК, но они различаются как по качеству, так и по количеству полученной ДНК. При выборе метода выделения ДНК необходимо учитывать множество факторов, включая стоимость, время, безопасность и риск заражения.

Органическая экстракция включает добавление и инкубацию в нескольких различных химических растворах; включая стадию лизиса , экстракцию фенолом хлороформом, осаждение этанолом и стадии промывки. Органическая экстракция часто используется в лабораториях, потому что она дешевая и дает большие количества чистой ДНК. Хотя это несложно, здесь много шагов, и это занимает больше времени, чем другие методы. Это также связано с неблагоприятным использованием токсичных химикатов фенола и хлороформа , и существует повышенный риск заражения из-за переноса ДНК между несколькими пробирками. Несколько протоколов, основанных на органической экстракции ДНК, были эффективно разработаны десятилетия назад, хотя в последние годы также были разработаны и опубликованы улучшенные и более практичные версии этих протоколов.

Метод экстракции Chelex включает добавление смолы Chelex к образцу, кипячение раствора, затем его встряхивание и центрифугирование. Клеточные материалы связываются с гранулами Chelex, а ДНК находится в супернатанте . Метод Chelex намного быстрее и проще, чем органическая экстракция, и для него требуется только одна пробирка, что снижает риск загрязнения ДНК. К сожалению, экстракция Chelex не дает такого большого количества, и полученная ДНК является одноцепочечной, что означает, что ее можно использовать только для анализов на основе ПЦР, но не для ПДРФ .

Твердофазная экстракция, такая как использование метода экстракции на спин-колонке, использует тот факт, что ДНК связывается с диоксидом кремния . Образец, содержащий ДНК, добавляют в колонку, содержащую силикагель или гранулы диоксида кремния и хаотропные соли. Хаотропные соли нарушают водородную связь между цепями и способствуют связыванию ДНК с диоксидом кремния, заставляя нуклеиновые кислоты становиться гидрофобными. Таким образом, остатки фосфата становятся доступными для адсорбции. ДНК связывается с диоксидом кремния, а остальная часть раствора вымывается этанолом для удаления хаотропных солей и других ненужных компонентов. Затем ДНК можно регидратировать водными растворами с низким содержанием солей, что позволяет элюировать ДНК из гранул.

Этот метод дает высококачественную, в основном, двухцепочечную ДНК, которую можно использовать как для ПЦР, так и для ПДРФ- анализа. Эта процедура может быть автоматизирована и имеет высокую производительность, хотя и более низкую, чем метод фенол-хлороформ . Это одностадийный метод, т.е. вся процедура выполняется в одной пробирке. Это снижает риск заражения, что делает его очень полезным для судебного извлечения ДНК. Коммерческие наборы для множественной твердофазной экстракции производятся и продаются разными компаниями; единственная проблема в том, что они дороже, чем органическая экстракция или экстракция Chelex.

Особые типы

Для выделения ДНК из некоторых образцов необходимо выбрать конкретные методы. Типичные образцы со сложным выделением ДНК:

  • археологические образцы, содержащие частично деградировавшую ДНК, см. древнюю ДНК
  • образцы, содержащие ингибиторы последующих процедур анализа, в первую очередь ингибиторы ПЦР , такие как гуминовая кислота из почвы, индиго и другие красители для тканей или гемоглобин в крови
  • образцы микроорганизмов с толстой клеточной стенкой, например дрожжей
  • образцы, содержащие смешанную ДНК из нескольких источников

Экстрахромосомную ДНК, как правило, легко выделить, особенно плазмиды можно легко выделить путем лизиса клеток с последующим осаждением белков, что улавливает хромосомную ДНК в нерастворимой фракции, а после центрифугирования плазмидную ДНК можно очистить от растворимой фракции.

Экстракция ДНК Hirt - это выделение всей внехромосомной ДНК в клетке млекопитающего. Процесс экстракции Hirt избавляет от высокомолекулярной ядерной ДНК , оставляя только низкомолекулярную митохондриальную ДНК и любые вирусные эписомы, присутствующие в клетке.

Обнаружение ДНК

Основная статья: Количественное определение нуклеиновых кислот

Индикатор дифениламина (DPA) подтвердит присутствие ДНК. Эта процедура включает химический гидролиз ДНК: при нагревании (например, ≥95 ° C) в кислоте реакция требует сахара дезоксирибозы и, следовательно, специфична для ДНК. В этих условиях 2-дезоксирибоза превращается в w-гидроксилевулиниловый альдегид, который реагирует с соединением, дифениламином, с образованием соединения синего цвета. Концентрацию ДНК можно определить, измеряя интенсивность поглощения раствора при длине волны 600 нм с помощью спектрофотометра и сравнивая со стандартной кривой известных концентраций ДНК.

Измерение интенсивности поглощения раствора ДНК при длинах волн 260 и 280 нм используется в качестве меры чистоты ДНК. ДНК можно определить количественно, разрезав ДНК рестрикционным ферментом , пропустив ее на агарозном геле , окрашивая бромидом этидия (EtBr) или другим красителем и сравнивая интенсивность ДНК с маркером ДНК известной концентрации.

Используя метод Саузерн-блоттинга , эту количественно определенную ДНК можно выделить и исследовать далее с помощью ПЦР и ПДРФ- анализа. Эти процедуры позволяют дифференцировать повторяющиеся последовательности в геноме. Именно эти методы используют криминалисты для сравнения, идентификации и анализа.

Метод выделения высокомолекулярной ДНК

В этом методе ядра растений выделяются путем физического измельчения тканей и восстановления неповрежденных ядер в уникальном буфере для ядерной изоляции (NIB). Пластидные ДНК высвобождаются из органелл и удаляются осмотическим буфером путем промывки и центрифугирования. Затем очищенные ядра лизируют и дополнительно очищают путем органической экстракции, а геномную ДНК осаждают с помощью высокой концентрации CTAB. Высокочистая высокомолекулярная гДНК извлекается из ядер, растворяется в буфере с высоким pH, что обеспечивает стабильное долгосрочное хранение.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

  • Сэмбрук, Майкл Р. Грин, Джозеф. Молекулярное клонирование . (4-е изд. Изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пр. ISBN  1936113422 .
  • Судебная биология, Ричард Ли, (2015) Бока-Ратон: CRC Press, Taylor & Francis Group. ISBN  9781439889701

внешние ссылки