Флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия - Fluorescence interference contrast microscopy

Микроскопия с флуоресцентным интерференционным контрастом (FLIC) - это микроскопический метод, разработанный для достижения z-разрешения в нанометровом масштабе.

FLIC возникает всякий раз, когда флуоресцентные объекты находятся вблизи отражающей поверхности (например, кремниевой пластины). Возникающая интерференция между прямым и отраженным светом приводит к двойной модуляции sin ² интенсивности I флуоресцентного объекта как функции расстояния h над отражающей поверхностью. Это позволяет измерять высоту в нанометрах .

Микроскоп FLIC хорошо подходит для измерения топографии мембраны, содержащей флуоресцентные зонды, например, искусственного липидного бислоя , мембраны живой клетки или структуры флуоресцентно меченых белков на поверхности.

Оптическая теория FLIC

Общая двухслойная система

Оптическая теория, лежащая в основе FLIC, была разработана Армином Ламбахером и Питером Фромхерцем. Они установили зависимость между наблюдаемой интенсивностью флуоресценции и расстоянием от флуорофора до отражающей поверхности кремния .

Наблюдаемая интенсивность флуоресценции является произведением вероятности возбуждения в единицу времени и вероятности измерения излучаемого фотона в единицу времени . Обе вероятности являются функцией высоты флуорофора над поверхностью кремния, поэтому наблюдаемая интенсивность также будет функцией высоты флуорофора. Простейшее устройство для рассмотрения - флуорофор, встроенный в диоксид кремния (показатель преломления ) на расстоянии d от границы раздела с кремнием (показатель преломления ). Флуорофор возбуждается светом с длиной волны и излучает свет с длиной волны . Единичный вектор дает ориентацию переходного диполя возбуждения флуорофора. пропорциональна квадрату проекции локального электрического поля , включающего эффекты интерференции , на направление диполя перехода. На локальное электрическое поле флуорофора влияет интерференция между прямым падающим светом и светом, отражающимся от поверхности кремния. Интерференция количественно определяется разностью фаз, определяемой как угол падающего света по отношению к нормали плоскости кремния. Мало того, что интерференция модулирует , но и поверхность кремния не идеально отражает падающий свет. Коэффициенты Френеля дают изменение амплитуды между падающей и отраженной волнами. Коэффициенты Френеля зависят от углов падения и , показателей преломления двух сред и направления поляризации . Углы и могут быть связаны законом Снеллиуса . Выражения для коэффициентов отражения следующие: TE относится к компоненту электрического поля, перпендикулярному плоскости падения, а TM - к параллельной составляющей (плоскость падения определяется нормалью к плоскости и направлением распространения света). В декартовых координатах локальное электрическое поле - это угол поляризации падающего света по отношению к плоскости падения. Ориентация диполя возбуждения является функцией его угла к нормали и азимутального к плоскости падения. Два приведенных выше уравнения для и можно объединить, чтобы получить вероятность возбуждения флуорофора в единицу времени . Многие из использованных выше параметров в обычном эксперименте могут отличаться. В это теоретическое описание следует включить изменение пяти следующих параметров. ${\ displaystyle I_ {FLIC}}$${\ displaystyle P_ {ex}}$${\ displaystyle P_ {em}}$${\ displaystyle n_ {1}}$${\ displaystyle n_ {0}}$${\ displaystyle \ lambda _ {ex}}$${\ displaystyle \ lambda _ {em}}$${\ displaystyle '' e_ {ex} ''}$${\ displaystyle P_ {ex}}$${\ displaystyle F_ {in}}$
${\ Displaystyle P_ {ex} \ propto \ mid F_ {in} \ cdot e_ {ex} \ mid ^ {2}}$
${\ displaystyle F_ {in}}$${\ displaystyle \ Phi _ {in}}$
${\ displaystyle \ Phi _ {in} = {\ frac {4 \ pi n_ {1} d \ cos \ theta _ {1} ^ {in}} {\ lambda _ {ex}}}}$
${\ displaystyle \ theta _ {1} ^ {in}}$${\ displaystyle F_ {in}}$${\ displaystyle \ theta _ {я}}$${\ displaystyle \ theta _ {j}}$${\ displaystyle \ theta _ {я}}$${\ displaystyle \ theta _ {j}}$
${\ displaystyle r_ {ij} ^ {TE} = {\ frac {n_ {i} \ cos \ theta _ {i} -n_ {j} \ cos \ theta _ {j}} {n_ {i} \ cos \ theta _ {i} + n_ {j} \ cos \ theta _ {j}}} \ quad r_ {ij} ^ {TM} = {\ frac {n_ {j} \ cos \ theta _ {i} -n_ { i} \ cos \ theta _ {j}} {n_ {j} \ cos \ theta _ {i} + n_ {i} \ cos \ theta _ {j}}}}$

${\ displaystyle F_ {in} = \ sin \ gamma _ {in} \ left [{\ begin {array} {c} 0 \\ 1 + r_ {10} ^ {TE} {\ textit {e}} ^ { i \ Phi _ {in}} \\ 0 \ end {array}} \ right] + \ cos \ gamma _ {in} \ left [{\ begin {array} {c} \ cos \ theta _ {1} ^ {in} (1-r_ {10} ^ {TM} {\ textit {e}} ^ {i \ Phi _ {in}}) \\ 0 \\\ sin \ theta _ {1} ^ {in} ( 1 + r_ {10} ^ {TM} {\ textit {e}} ^ {i \ Phi _ {in}}) \ end {array}} \ right]}$
${\ displaystyle \ gamma _ {in}}$${\ displaystyle \ theta _ {ex}}$${\ displaystyle \ phi _ {ex}}$
${\ displaystyle {\ textit {e}} _ {ex} = \ left [{\ begin {array} {c} \ cos \ phi _ {ex} \ sin \ theta _ {ex} \\\ sin \ phi _ {ex} \ sin \ theta _ {ex} \\\ cos \ theta _ {ex} \ end {array}} \ right]}$
${\ displaystyle F_ {in}}$${\ displaystyle {\ textit {e}} _ {ex}}$${\ displaystyle P_ {ex}}$

• Когерентности возбуждающего света
• Угол падения ( ) возбуждающего света${\ displaystyle \ theta _ {1} ^ {in}}$
• Угол поляризации ( ) возбуждающего света${\ displaystyle \ gamma _ {in}}$
• Угол перехода диполя ( ) флуорофора${\ displaystyle \ theta _ {ex}}$
• Длина волны возбуждающего света ( )${\ displaystyle \ lambda _ {ex}}$

Квадрат проекции должен быть усреднен по этим величинам, чтобы определить вероятность возбуждения . Усреднение по первым 4 параметрам дает ${\ displaystyle \ mid F_ {in} \ cdot e_ {ex} \ mid ^ {2}}$${\ displaystyle P_ {ex}}$
${\ displaystyle <\ mid F_ {in} \ cdot e_ {ex} \ mid ^ {2}> \ propto \ int \ sin \ theta _ {1} ^ {in} d \ theta _ {1} ^ {in} A_ {in} (\ theta _ {1} ^ {in}) \ times \ int \ sin \ theta _ {ex} d \ theta _ {ex} O (\ theta _ {ex}) U_ {ex} (\ лямбда _ {in}, \ theta _ {1} ^ {in}. \ theta _ {ex})}$ ${\ displaystyle U_ {ex} = \ sin ^ {2} \ theta _ {ex} \ mid 1 + r_ {10} ^ {TE} {\ textit {e}} ^ {i \ Phi _ {in}} \ mid ^ {2} + \ sin ^ {2} \ theta _ {ex} \ cos ^ {2} \ theta _ {1} ^ {in} \ mid 1-r_ {10} ^ {TM} {\ textit { e}} ^ {i \ Phi _ {in}} \ mid ^ {2} +2 \ cos ^ {2} \ theta _ {ex} \ sin ^ {2} \ theta _ {1} ^ {in} \ mid 1 + r_ {10} ^ {TM} {\ textit {e}} ^ {i \ Phi _ {in}} \ mid ^ {2}}$

Пример графика интенсивности FLIC, показывающий измеренную относительную интенсивность флуоресценции в зависимости от расстояния флуорофора от отражающей поверхности. Пики могут быть разной высоты на реальном экспериментальном участке.

Коэффициенты нормализации не включены. представляет собой распределение угла ориентации диполей флуорофора. Азимутальный угол и угол поляризации не интегрируются по аналитически, так что они больше не появляются в приведенном выше уравнении. Чтобы окончательно получить вероятность возбуждения в единицу времени, приведенное выше уравнение интегрируется по разбросу длин волн возбуждения с учетом интенсивности и коэффициента экстинкции флуорофора . Шаги для вычисления эквивалентны шагам , описанным выше при вычислении, за исключением того, что метки параметров em заменяются на ex, а in заменяются на out . Результирующая измеренная интенсивность флуоресценции пропорциональна произведению вероятности возбуждения и вероятности испускания. ${\ Displaystyle О (\ тета _ {экс})}$${\ displaystyle \ phi _ {ex}}$${\ displaystyle \ gamma _ {in}}$${\ displaystyle I (\ lambda _ {ex})}$${\ displaystyle \ epsilon (\ lambda _ {ex})}$
${\ displaystyle P_ {ex} \ propto \ int d \ lambda _ {ex} I (\ lambda _ {ex}) \ epsilon (\ lambda _ {ex}) <\ mid F_ {in} \ cdot e_ {ex} \ mid ^ {2}>}$
${\ displaystyle P_ {em}}$${\ displaystyle P_ {ex}}$
${\ displaystyle P_ {em} \ propto \ int d \ lambda _ {em} \ Phi _ {det} (\ lambda _ {em}) {\ textit {f}} (\ lambda _ {em}) <\ mid F_ {in} \ cdot e_ {ex} \ mid ^ {2}>}$

${\ displaystyle I_ {FLIC} \ propto P_ {ex} P_ {em}}$
Важно отметить, что эта теория определяет соотношение пропорциональности между измеренной интенсивностью флуоресценции и расстоянием от флуорофора над отражающей поверхностью. Тот факт, что это отношение не равно равенству, окажет существенное влияние на экспериментальную процедуру. ${\ displaystyle I_ {FLIC}}$

Экспериментальная установка

Кремниевая пластина обычно используется в качестве отражающей поверхности в эксперименте FLIC. Затем поверх кремниевой пластины термически выращивают оксидный слой, который действует как прокладка. Поверх оксида помещают флуоресцентно меченый образец, такой как липидная мембрана, белки, связанные с клеткой или мембраной. После создания системы отбора проб все, что требуется, - это эпифлуоресцентный микроскоп и камера CCD для количественных измерений интенсивности.

Это схема примерной экспериментальной установки FLIC с кремнием, тремя оксидными слоями и флуоресцентно меченным липидным бислоем (желтые звезды представляют флуорофоры.

Толщина диоксида кремния очень важна для точных измерений FLIC. Как упоминалось ранее, теоретическая модель описывает относительную интенсивность флуоресценции, измеренную в зависимости от высоты флуорофора. Положение флуорофора нельзя просто определить по одной измеренной кривой FLIC. Основная процедура заключается в изготовлении оксидного слоя, по крайней мере, двух известных толщин (слой может быть изготовлен фотолитографическими методами, а толщина измеряется эллипсометрией ). Используемая толщина зависит от измеряемого образца. Для образца с высотой флуорофора в диапазоне 10 нм лучше всего подойдет толщина оксида около 50 нм, потому что кривая интенсивности FLIC здесь самая крутая и будет давать наибольший контраст между высотой флуорофора. Толщина оксида более нескольких сотен нанометров может быть проблематичной, потому что кривая начинает размываться из-за полихроматического света и диапазона углов падения. Отношение измеренных интенсивностей флуоресценции при различной толщине оксида сравнивается с прогнозируемым соотношением для расчета высоты флуорофора над оксидом ( ). Вышеупомянутое уравнение затем можно решить численно, чтобы найти . Недостатки эксперимента, такие как несовершенное отражение, ненормальное падение света и полихроматический свет, имеют тенденцию размывать резкие кривые флуоресценции. Разбросом угла падения можно управлять с помощью числовой апертуры (NA). Однако, в зависимости от используемой числовой апертуры, эксперимент даст хорошее разрешение по горизонтали (xy) или хорошее разрешение по вертикали (z), но не то и другое одновременно. Высокое значение NA (~ 1.0) дает хорошее разрешение по горизонтали, которое лучше всего подходит для определения топографии на большом расстоянии. Низкая числовая апертура (~ 0,001), с другой стороны, обеспечивает точное измерение z-высоты для определения высоты флуоресцентно меченой молекулы в системе. ${\ displaystyle d _ {\ textit {f}},}$
${\ Displaystyle {\ frac {I_ {теория} (d_ {1})} {I_ {теория} (d_ {0})}} = {\ frac {I_ {exp} (d_ {1} + d _ {\ textit {f}})} {I_ {exp} (d_ {0} + d _ {\ textit {f}})}}}$
${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$

Анализ

Пример экспериментальных данных, собранных для флуоресцентно меченного образца более 16 толщин оксида. Подгонка кривой к 16 точкам данных даст высоту флуорофоров над поверхностью оксида.

Базовый анализ включает подгонку данных интенсивности с теоретической моделью, позволяющей расстоянию от флуорофора над поверхностью оксида ( ) быть свободным параметром. Кривые FLIC смещаются влево по мере увеличения расстояния флуорофора над оксидом. обычно является параметром, представляющим интерес, но для оптимизации соответствия часто включаются несколько других свободных параметров. Обычно включаются коэффициент амплитуды (а) и постоянный аддитивный член для фона (b). Коэффициент амплитуды масштабирует относительную интенсивность модели, а постоянный фон сдвигает кривую вверх или вниз, чтобы учесть флуоресценцию, исходящую из областей вне фокуса, таких как верхняя сторона ячейки. Иногда числовая апертура (NA) микроскопа может быть свободным параметром при подгонке. Другие параметры, входящие в оптическую теорию, такие как различные показатели преломления, толщины слоев и длины световых волн, считаются постоянными с некоторой неопределенностью. Микросхема FLIC может быть выполнена с оксидными террасами 9 или 16 разной высоты, расположенными в блоках. После получения флуоресцентного изображения каждый блок из 9 или 16 террас дает отдельную кривую FLIC, которая определяет уникальную . Среднее значение находится путем компиляции всех значений в гистограмму. Статистическая погрешность в расчете поступает из двух источников: ошибка в установке оптической теории к данным и неопределенности в толщине слоя оксида. Систематическая ошибка возникает из трех источников: измерения толщины оксида (обычно с помощью эллипсометра), измерения интенсивности флуоресценции с помощью ПЗС и неопределенности параметров, используемых в оптической теории. Систематическая ошибка оценивается в . ${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$
${\ displaystyle d _ {\ textit {f}}}$${\ displaystyle \ sim 1nm}$

использованная литература

• Аджо-Франклин, Кэролайн М .; Ёсина-Исии, Чиаки; Боксер, Стивен Г. (2005). «Исследование структуры поддерживаемых мембран и связанных олигонуклеотидов с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюра . Американское химическое общество (ACS). 21 (11): 4976–4983. DOI : 10.1021 / la0468388 . ISSN  0743-7463 . PMID  15896039 .
• Braun, D .; Фромгерц, П. (1997-10-01). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия клеточной адгезии на окисленном кремнии». Прикладная физика A: Материаловедение и обработка материалов . ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 65 (4–5): 341–348. Bibcode : 1997ApPhA..65..341B . DOI : 10.1007 / s003390050589 . ISSN  0947-8396 . S2CID  16478620 .
• Браун, Дитер; Фромгерц, Питер (1998-12-07). «Флуоресцентная интерферометрия адгезии нейрональных клеток на микроструктурированном кремнии». Письма с физическим обзором . Американское физическое общество (APS). 81 (23): 5241–5244. Bibcode : 1998PhRvL..81.5241B . DOI : 10.1103 / physrevlett.81.5241 . ISSN  0031-9007 .
• Крейн, Джонатан М .; Кисслинг, Фолькер; Тамм, Лукас К. (2005). «Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоев с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюра . Американское химическое общество (ACS). 21 (4): 1377–1388. DOI : 10.1021 / la047654w . ISSN  0743-7463 . PMID  15697284 .
• Кайдзука, Ёсихиса; Гровс, Джей Т. (20 марта 2006 г.). «Гидродинамическое демпфирование тепловых колебаний мембраны вблизи поверхностей, полученных с помощью флуоресцентной интерференционной микроскопии». Письма с физическим обзором . Американское физическое общество (APS). 96 (11): 118101. Bibcode : 2006PhRvL..96k8101K . DOI : 10.1103 / physrevlett.96.118101 . ISSN  0031-9007 . PMID  16605875 .
• Кисслинг, Фолькер; Тамм, Лукас К. (2003). «Измерение расстояний в поддерживаемых бислоев с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии: полимерные подложки и белки SNARE» . Биофизический журнал . Elsevier BV. 84 (1): 408–418. Bibcode : 2003BpJ .... 84..408K . DOI : 10.1016 / s0006-3495 (03) 74861-9 . ISSN  0006-3495 . PMC  1302622 . PMID  12524294 .
• Ламбахер, Армин; Фромгерц, Питер (1996). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия на окисленном кремнии с использованием мономолекулярного слоя красителя». Прикладная физика A: Материаловедение и обработка материалов . ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 63 (3): 207–216. Bibcode : 1996ApPhA..63..207L . DOI : 10.1007 / bf01567871 . ISSN  0947-8396 . S2CID  16072847 .
• Ламбахер, Армин; Фромхерц, Питер (2002-06-01). «Люминесценция молекул красителя на окисленном кремнии и флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия биомембран». Журнал Оптического общества Америки B . Оптическое общество. 19 (6): 1435–1453. Bibcode : 2002JOSAB..19.1435L . DOI : 10,1364 / josab.19.001435 . ISSN  0740-3224 .
• Партасарати, Рагувир; Гровс, Джей Т. (2004). "Оптические методы визуализации топографии мембраны". Биохимия и биофизика клетки . ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 41 (3): 391–414. DOI : 10.1385 / cbb: 41: 3: 391 . ISSN  1085-9195 . PMID  15509889 . S2CID  11674192 .