Флуоресцентный микроскоп - Fluorescence microscope

Вертикальный флуоресцентный микроскоп (Olympus BX61) с турелью в виде куба флуоресцентного фильтра над линзами объектива, соединенный с цифровой камерой.

Воспроизвести медиа

Принцип работы флуоресцентного и конфокального микроскопов

Флуоресцентный микроскоп представляет собой оптический микроскоп , который использует флюоресценции вместо или в дополнение к нему рассеяния , отражения и затухания или поглощения , чтобы исследовать свойства органических или неорганических веществ. «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп , в котором используется оптическое сечение для получения лучшего разрешения флуоресцентного изображения. .

Принцип

Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет с большей длиной волны (т. Е. Другого цвета, чем поглощенный свет). Освещающий свет отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции с помощью спектрального эмиссионного фильтра. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света (распространены ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа ; более совершенные формы - мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) и излучатель. фильтр (см. рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. Таким образом, одновременно отображается распределение одного флуорофора (цвета). Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров необходимо составлять путем объединения нескольких одноцветных изображений.

Большинство используемых флуоресцентных микроскопов представляют собой эпифлуоресцентные микроскопы, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же световой путь (то есть через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более совершенных конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).

Эпифлуоресцентная микроскопия

Схема флуоресцентного микроскопа.

Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно используемых в биологических науках , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на диаграмме. Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через объективную линзу. Флуоресценции , испускаемые образец фокусируются на детектор с помощью одной и тех же целей , который используется для возбуждения , который для разрешения большего потребуется объектив с более высокой числовой апертурой . Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с излучаемым светом, и поэтому метод эпифлуоресценции дает высокое отношение сигнал / шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр, зависящий от длины волны, пропускающий флуоресцентный свет через окуляр или детектор, но отражающий оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику.

Источники света

Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы . Используются четыре основных типа источников света, включая ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтинуума и мощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с фильтром дихроичного возбуждения обычно используются для широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов. Поместив две решетки микролинз на путь освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа, можно добиться очень однородного освещения с коэффициентом вариации 1-2%.

Базовые приготовления

Воспроизвести медиа

3D-анимация диатомовой водоросли Corethron sp.
Отображает наложения с четырех флуоресцентных каналов

(a) Зеленый: [DiOC6 (3) флуоресценция] - окрашивает клеточные мембраны, указывая на тела основных клеток.
(b) Голубой: [флуоресценция PLL-A546] - общий контраст для визуализации поверхностей эукариотических клеток
(c) Синий: [флуоресценция Hoechst] - окрашивает ДНК, идентифицирует ядра
(d) Красный: [автофлуоресценция хлорофилла] - рассасывает хлоропласты

Анимация начинается с наложения всех доступных флуоресцентных каналов, а затем уточняет визуализацию, включая и выключая каналы.

Образец спермы сельди, окрашенный зеленым SYBR в кювете, освещенный синим светом в эпифлуоресцентном микроскопе. Зеленый SYBR в образце связывается с ДНК сперматозоидов сельди и после связывания флуоресцирует, испуская зеленый свет при освещении синим светом.

Чтобы образец подходил для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Есть несколько методов создания флуоресцентного образца; основные методы маркировки с флуоресцентными пятнами , или, в случае биологических образцов, экспрессии в виде флуоресцентного белка . В качестве альтернативы может использоваться собственная флуоресценция образца (т.е. автофлуоресценция ). В биологических науках флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, позволяющим специфическое и чувствительное окрашивание образца для определения распределения белков или других представляющих интерес молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов.

Биологические флуоресцентные пятна

Многие флуоресцентные красители были разработаны для ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами этого являются окрашивания нуклеиновых кислот, такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые УФ-светом) и DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые связывают малую бороздку ДНК , маркируя, таким образом, ядра клеток. Другие представляют собой лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были модифицированы с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин , который используется для окрашивания актиновых волокон в клетках млекопитающих . Новый пептид, известный как пептид гибридизации коллагена , также можно конъюгировать с флуорофорами и использовать для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание стенок растительных клеток осуществляется красителями или красителями, связывающими целлюлозу или пектин . Поиски флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать изображения растительных клеток в реальном времени, продолжаются.

Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, таких как флуоресцеин , Alexa Fluors или DyLight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую цель в образце.

Иммунофлуоресценция

Иммунофлуоресценция - это метод, который использует высокоспецифичное связывание антитела с его антигеном для мечения определенных белков или других молекул внутри клетки. Образец обрабатывают первичным антителом, специфичным для интересующей молекулы. Флуорофор можно напрямую конъюгировать с первичным антителом. В качестве альтернативы можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, вырабатываемое у мышей, которое распознает тубулин, в сочетании со вторичным антимышиным антителом, дериватизированным с флуорофором, можно использовать для мечения микротрубочек в клетке.

Флуоресцентные белки

Современное понимание генетики и доступных методов модификации ДНК позволяет ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также несли флуоресцентный белок-репортер. В биологических образцах это позволяет ученому непосредственно сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем можно напрямую отслеживать местоположение белка, в том числе в живых клетках.

Ограничения

Флуорофоры теряют способность к флуоресценции, когда они освещаются в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может сильно ограничить время, в течение которого образец можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более надежных флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных химикатов- поглотителей .

Флуоресцентная микроскопия с использованием флуоресцентных репортерных белков позволила анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки чувствительны к фототоксичности, особенно при использовании коротковолнового света. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать химически активные вещества при освещении, что усиливает фототоксический эффект.

В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете, флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только те структуры, которые были помечены как флуоресцентные. Например, наблюдение за образцом ткани, приготовленным с флуоресцентным окрашиванием ДНК, с помощью флуоресцентной микроскопии показывает только организацию ДНК внутри клеток и ничего не говорит о морфологии клеток.

Вычислительные методы, которые предлагают оценить флуоресцентный сигнал из нефлуоресцентных изображений (например, светлого поля), могут уменьшить эти проблемы. Как правило, эти подходы включают обучение глубокой сверточной нейронной сети на окрашенных клетках и затем оценку флуоресценции на неокрашенных образцах. Таким образом, путем отделения исследуемых клеток от клеток, используемых для обучения сети, визуализация может выполняться быстрее и со сниженной фототоксичностью.

Субдифракционные методы

Волновая природа света ограничивает размер пятна, в которое он может быть сфокусирован из-за дифракционного предела . Это ограничение было описано в XIX веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия занимает центральное место во многих методах, которые стремятся преодолеть этот предел с помощью специализированных оптических конфигураций.

В 20 веке были изобретены несколько усовершенствований в методах микроскопии, которые в некоторой степени привели к увеличению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи по преодолению этого барьера путем использования микроскопа 4Pi в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, в котором свет идеально фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта «точка за точкой». точечное возбуждение в сочетании с детектированием «точка за точкой». Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4pi состоялась в 1994 году. Микроскопия 4Pi максимизирует количество доступных направлений фокусировки за счет использования двух противоположных линз объектива или микроскопии с двухфотонным возбуждением с использованием красного смещения света и многофотонного возбуждения.

Интегрированная корреляционная микроскопия объединяет флуоресцентный микроскоп с электронным микроскопом. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки.

Первым методом, который действительно достиг субдифракционного разрешения, была STED-микроскопия , предложенная в 1994 году. Этот метод и все методы, следующие за концепцией RESOLFT, основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцентными молекулами. Молекулы сильно перемещаются между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, наконец, свет может излучаться только в небольшой части пространства, следовательно, повышенное разрешение.

Также в 1990-х годах был разработан другой метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широко-полевой микроскопии. Существенно улучшенное разрешение по размеру клеточных наноструктур, окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто за счет развития микроскопии локализации SPDM и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). Сочетание принципа SPDM с SMI привело к созданию микроскопа Vertico SMI . Обнаружение одной молекулы нормальных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто путем дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два разных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (это технология называется двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM).

С другой стороны, появление фотоактивированной микроскопии локализации может привести к аналогичным результатам, полагаясь на мигание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый момент времени очень мала. Этот стохастический отклик молекул на приложенный свет также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, приводящему к субдифракционному разрешению.

Галерея флуоресцентных микрофотографий

Z-проекция клетки остеосаркомы, окрашенная фаллоидином для визуализации актиновых нитей. Изображение было получено на конфокальном микроскопе, а последующая деконволюция была выполнена с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки.
Эпифлуоресцентное изображение трех компонентов делящейся раковой клетки человека. ДНК окрашивали синим, А белок , называемый INCENP зеленого цвета, а микротрубочки красные. Каждый флуорофор визуализируется отдельно с использованием различной комбинации фильтров возбуждения и излучения, и изображения снимаются последовательно с помощью цифровой камеры CCD , а затем накладываются друг на друга, чтобы получить полное изображение.
Эндотелиальные клетки под микроскопом. Ядра окрашены в синий цвет с помощью DAPI, микротрубочки помечены зеленым цветом по антителу, связанному с FITC, а филаменты актина помечены красным цветом с фаллоидином, связанным с TRITC. Эндотелиальные клетки легочной артерии крупного рогатого скота (BPAE)
Двухцветная трехмерная микроскопия сверхвысокого разрешения с Her2 и Her3 в клетках груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568. Микроскопия LIMON
Ядро лимфоцитов человека, окрашенное DAPI, с гибридизацией центромерных зондов 13 (зеленый) и 21 (красный) хромосомы ( флуоресцентная гибридизация in situ (FISH))
Мембрана дрожжевых клеток визуализируется некоторыми мембранными белками, слитыми с флуоресцентными маркерами RFP и GFP. Навязывание света от обоих маркеров приводит к желтому цвету.
Микроскопия сверхвысокого разрешения: обнаружение одной молекулы YFP в раковой клетке человека. Типичные измерения расстояний в диапазоне 15 нм, измеренные с помощью микроскопа Vertico-SMI / SPDMphymod
Микроскопия сверхвысокого разрешения: Совместная локализационная микроскопия (2CLM) с белками слияния GFP и RFP (ядро клетки рака кости) 120 000 локализованных молекул в широкой области (470 мкм ² ), измеренной с помощью микроскопа Vertico-SMI / SPDMphymod
Флуоресцентная микроскопия экспрессии ДНК в области человеческого дикого типа и мутантного P239S Палладина .
На изображениях флуоресцентной микроскопии патологии солнечных вспышек в клетке крови пораженные участки показаны красным цветом.