Гель-электрофорез белков - Gel electrophoresis of proteins

Белки, разделенные с помощью SDS-PAGE , окрашивания кумасси бриллиантовым синим

Электрофорез белков - это метод анализа белков в жидкости или экстракте. Электрофорез может быть проведен с небольшим объемом образца рядом альтернативных способов с или без поддерживающей среды: электрофорез в полиакриламидном геле с SDS (коротко: гель-электрофорез, PAGE или SDS-электрофорез), электрофорез в свободном потоке , электрофокусирование , изотахофорез , аффинный электрофорез , иммуноэлектрофорез , контрэлектрофорез и капиллярный электрофорез . Каждый метод имеет множество вариаций с индивидуальными преимуществами и ограничениями. Гель-электрофорез часто проводят в сочетании с электроблоттингом и иммуноблоттингом, чтобы получить дополнительную информацию о конкретном белке. Из-за практических ограничений электрофорез белков обычно не подходит в качестве препаративного метода.

Денатурирующие гелевые методы

SDS-СТРАНИЦА

SDS-PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия , описывает набор связанных методов разделения белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функция молекулярной массы полипептидной цепи) в денатурированном (развернутом) состоянии. В большинстве белков связывание SDS с полипептидной цепью обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза.

SDS - сильный детергент, используемый для денатурирования нативных белков до развернутых индивидуальных полипептидов . Когда смесь белков нагревается до 100 ° C в присутствии SDS, детергент оборачивается вокруг основы полипептида. В этом процессе внутренние заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержневидными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть одинаковым суммарным отрицательным зарядом на единицу длины. Электрофоретическая подвижность этих белков будет линейной функцией логарифмов их молекулярных масс.

Нативные гелевые методы

Нативные гели, также известные как неденатурирующие гели, анализируют белки, которые все еще находятся в свернутом состоянии. Таким образом, электрофоретическая подвижность зависит не только от отношения заряда к массе, но также от физической формы и размера белка.

Синяя родная СТРАНИЦА

BN-PAGE - это нативный метод PAGE , в котором краситель кумасси бриллиантовый синий обеспечивает необходимые заряды для белковых комплексов для электрофоретического разделения. Недостатком кумасси является то, что при связывании с белками он может действовать как детергент, вызывая диссоциацию комплексов . Другой недостатком является потенциальной закалкой из хемилюминесценции (например , в последующем Вестерне - блот обнаружение активности или анализах) или флуоресценция белков с протезами групп (например , гем или хлорофилл ) или метил флуоресцентные красители.

Очистить родную СТРАНИЦУ

CN-PAGE (обычно называемый Native PAGE) разделяет кислые водорастворимые и мембранные белки в полиакриламидном градиентном геле. В нем не используется заряженный краситель, поэтому электрофоретическая подвижность белков в CN-PAGE (в отличие от метода сдвига заряда BN-PAGE) связана с внутренним зарядом белков. Расстояние миграции зависит от заряда белка, его размера и размера пор геля. Во многих случаях этот метод имеет более низкое разрешение, чем BN-PAGE, но CN-PAGE предлагает преимущества всякий раз, когда краситель кумасси мешает дальнейшим аналитическим методам, например, он был описан как очень эффективный метод разделения на микромасштабе для анализа FRET . Кроме того, CN-PAGE более мягкий, чем BN-PAGE, поэтому он может сохранять лабильные супрамолекулярные сборки комплексов мембранных белков , которые диссоциируют в условиях BN-PAGE.

Количественная родная СТРАНИЦА

В сложенном белковые комплексы интересных отделить чисто и предсказуемо из - за специфических свойств полиакриламидного геля. Разделенные белки непрерывно элюируются физиологическим элюентом и транспортируются в коллектор фракций. В четырех-пяти фракциях PAGE каждый металлический кофактор может быть идентифицирован и абсолютно количественно определен с помощью ICP-MS высокого разрешения . Соответствующие структуры изолированных металлопротеинов можно определить с помощью спектроскопии ЯМР в растворе .

Буферные системы

Предполагаемая миграция белков в гелевой системе Лэммли A: Укладывающий гель, B: Рассасывающийся гель, o: нанесение образца c: неоднородности в буфере и электрофоретической матрице

Большинство разделений белков выполняется с использованием «прерывистой» (или DISC) буферной системы, которая значительно увеличивает резкость полос внутри геля. Во время электрофореза в прерывистой гелевой системе на ранней стадии электрофореза образуется ионный градиент, который заставляет все белки фокусироваться в единую резкую полосу. Формирование ионного градиента достигается за счет выбора значения pH, при котором ионы буфера заряжены только умеренно по сравнению с белками, покрытыми SDS. Эти условия создают среду, в которой реакции Кольрауша определяют молярную проводимость . В результате белки, покрытые SDS, концентрируются в несколько раз в тонкой зоне порядка 19 мкм в течение нескольких минут. На этом этапе все белки мигрируют с одинаковой скоростью миграции за счет изотахофореза . Это происходит в области геля, которая имеет более крупные поры, так что гелевая матрица не задерживает миграцию во время фокусировки или «наложения». Разделение белков по размеру достигается в нижней, «разрешающейся» области геля. Разлагающийся гель обычно имеет гораздо меньший размер пор, что приводит к эффекту просеивания, который теперь определяет электрофоретическую подвижность белков. В то же время разделяющая часть геля также имеет значение pH, при котором ионы буфера в среднем несут больший заряд, заставляя их «опережать» белки, покрытые SDS, и устранять ионный градиент и тем самым эффект суммирования.

Очень распространенной прерывистой буферной системой является трис-глицин или система « Лэммли », которая складывается при pH 6,8 и растворяется при pH ~ 8,3-9,0. Недостатком этой системы является то, что эти значения pH могут способствовать образованию дисульфидной связи между остатками цистеина в белках, поскольку pKa цистеина находится в диапазоне от 8 до 9 и поскольку восстанавливающий агент, присутствующий в загрузочном буфере, не мигрирует вместе с белками. Последние достижения в технологии буферизации облегчают эту проблему, растворяя белки при pH значительно ниже pKa цистеина (например, бис-трис , pH 6,5) и включая восстанавливающие агенты (например, бисульфит натрия), которые переходят в гель перед белками, чтобы поддерживать восстанавливающую среду. Дополнительным преимуществом использования буферов с более низкими значениями pH является то, что акриламидный гель более стабилен при более низких значениях pH, поэтому гели можно хранить в течение длительных периодов времени перед использованием.

SDS-градиентный гель-электрофорез белков

При приложении напряжения анионы (и отрицательно заряженные молекулы образца) перемещаются к положительному электроду (аноду) в нижней камере, ведущим ионом является Cl - (высокая подвижность и высокая концентрация); глицинат - конечный ион (низкая подвижность и низкая концентрация). Частицы SDS-белка не перемещаются свободно на границе между Cl - гелевого буфера и Gly - катодного буфера. Фридрих Кольрауш обнаружил, что закон Ома также применим к растворенным электролитам . Из - за падения напряжения между Cl - и глицин-буферы, белки сжаты (уложены) в микрометрических тонких слоев. Граница перемещается через градиент пор, и стек белков постепенно диспергируется из-за увеличения сопротивления трения гелевой матрицы. Укладка и разборка происходит непрерывно в градиентном геле для каждого белка в разных положениях. Для полного разделения белка концентрация полиакриламидного геля должна превышать 16% T. Двухгелевая система «Laemmli» представляет собой простой градиентный гель. Неравномерность pH буферов не имеет значения для качества разделения, и «стекинг-гель» с другим pH не требуется.

Визуализация

Самым популярным белковым красителем является кумасси бриллиантовый синий . Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенного в гель, можно удалить, обесцвечивая тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на прозрачном фоне.

Когда требуется более чувствительный метод, чем окрашивание Кумасси, обычно используется окрашивание серебром. Окрашивание серебром - чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях, но также может визуализировать нуклеиновые кислоты или полисахариды.

На рынке доступны методы визуализации без использования красителей, таких как кумасси и серебро. Например, Bio-Rad Laboratories продает гели без пятен для электрофореза в геле SDS-PAGE. В качестве альтернативы можно использовать обратимые флуоресцентные красители из Azure Biosystems, такие как AzureRed или Azure TotalStain Q.

Так же, как и в гель-электрофорезе нуклеиновых кислот, часто используется трекинг-краситель . Анионные красители с известной электрофоретической подвижностью обычно включают в буфер для образца. Очень распространенный следящий краситель - это бромфеноловый синий . Этот краситель окрашен при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду. Будучи высокомобильной молекулой, он опережает большинство белков.

Медицинские приложения

Схематическое изображение геля для электрофореза белков.
Электрофорез сывороточного протеина показывает парапротеин (пик в гамма-зоне) у пациента с множественной миеломой .

В медицине , белок - электрофорез представляет собой метод анализа белков в основном в сыворотке крови . До широкого использования гель-электрофореза белковый электрофорез выполняли как электрофорез в свободном потоке (на бумаге) или как иммуноэлектрофорез.

Традиционно рассматриваются два класса белков крови : сывороточный альбумин и глобулин . Как правило, они равны по пропорции, но альбумин как молекула намного меньше и имеет слабый отрицательный заряд, что приводит к накоплению альбумина на электрофоретическом геле. Небольшая полоса перед альбумином представляет транстиретин (также называемый преальбумином). Некоторые лекарственные препараты или химические вещества в организме могут вызвать образование собственной полосы, но обычно она небольшая. Аномальные полосы (спайки) наблюдаются при моноклональной гаммопатии неопределенного значения и множественной миеломе и полезны при диагностике этих состояний.

Глобулины классифицируются по рисунку полос (с их основными представителями):

Обычная медицинская процедура в настоящее время включает определение многочисленных белков в плазме, включая гормоны и ферменты, некоторые из них также определяются с помощью электрофореза. Однако гель-электрофорез - это в основном инструмент исследования, в том числе и в случае белков крови.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки