Моноклональные антитела - Monoclonal antibody

Общее представление о методе получения моноклональных антител.

Моноклональное антитело ( монАТ или Моав ) представляет собой антитело , сделанное клонирование уникальную лейкоцита . Все последующие антитела, полученные таким образом, восходят к уникальной родительской клетке.

Моноклональные антитела могут иметь моновалентную аффинность, связываясь только с одним и тем же эпитопом (той частью антигена, которая распознается антителом). Напротив, поликлональные антитела связываются с множеством эпитопов и обычно образуются несколькими разными линиями плазматических клеток, секретирующих антитела . Биспецифические моноклональные антитела также могут быть созданы путем увеличения терапевтических мишеней одного моноклонального антитела до двух эпитопов.

Можно получить моноклональные антитела, которые специфически связываются практически с любым подходящим веществом; затем они могут служить для его обнаружения или очистки. Эта способность стала важным инструментом в биохимии , молекулярной биологии и медицине .

История

В начале 1900-х годов иммунолог Пауль Эрлих предложил идею Zauberkugel - « волшебной пули », задуманной как соединение, которое избирательно нацелено на болезнетворный организм и может доставить токсин для этого организма. Это лежало в основе концепции моноклональных антител и конъюгатов моноклональных лекарственных средств. Эрлих и Эли Мечников получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1908 года за теоретические основы иммунологии.

К 1970-м годам были известны лимфоциты, продуцирующие одно антитело, в форме множественной миеломы - рака, поражающего В-клетки . Эти аномальные антитела или парапротеины использовались для изучения структуры антител, но еще не было возможности получить идентичные антитела, специфичные к данному антигену . В 1973 году Джеррольд Швабер описал получение моноклональных антител с использованием гибридных клеток человека и мыши. Эта работа по-прежнему широко цитируется среди тех, кто использует гибридомы человеческого происхождения . В 1975 году Жоржу Кёлеру и Сезару Мильштейну удалось осуществить слияние линий миеломных клеток с В-клетками, чтобы создать гибридомы, которые могут продуцировать антитела, специфичные к известным антигенам, и которые были увековечены. Они и Нильс Кай Йерн разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1984 году за это открытие.

В 1988 году Грег Винтер и его команда первыми разработали методы гуманизации моноклональных антител, устраняя реакции, которые многие моноклональные антитела вызывали у некоторых пациентов. К 1990-м годам исследования достигли прогресса в терапевтическом использовании моноклональных антител, и в 2018 году Джеймс П. Эллисон и Тасуку Хондзё получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие лечения рака путем ингибирования негативной иммунной регуляции с использованием моноклональных антител, предотвращающих тормозящие связи.

Производство

Исследователи рассматривают слайды культур клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Они выращиваются в лаборатории, и исследователи анализируют продукты, чтобы выбрать наиболее перспективные из них.
Моноклональные антитела можно выращивать в неограниченных количествах во флаконах, подобных показанным на этом рисунке.
Техник вручную заполняет лунки жидкостью для исследовательского теста. Этот тест включает приготовление культур, в которых гибриды выращиваются в больших количествах для получения желаемых антител. Это достигается путем слияния миеломной клетки и лимфоцита мыши с образованием гибридной клетки ( гибридомы ).
Лаборант купания подготовил слайды в растворе. Этот техник готовит для исследователей слайды с моноклональными антителами. Показанные клетки маркируют рак груди человека .

Развитие гибридомы

Большая часть работы по производству моноклональных антител уходит корнями в производство гибридом, которое включает идентификацию антиген-специфических клеток плазмы / плазмобластов (ASPC), которые продуцируют антитела, специфичные к интересующему антигену, и слияние этих клеток с клетками миеломы . В-клетки кролика можно использовать для образования гибридомы кролика . Полиэтиленгликоль используется для слияния соседних плазматических мембран, но вероятность успеха низкая, поэтому используется селективная среда, в которой могут расти только слитые клетки. Это возможно, потому что клетки миеломы утратили способность синтезировать гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (HGPRT), фермент, необходимый для синтеза нуклеиновых кислот. Отсутствие HGPRT не является проблемой для этих клеток, если также не нарушен путь синтеза пуринов de novo . Воздействие на клетки аминоптерина ( аналог фолиевой кислоты , который ингибирует дигидрофолатредуктазу , DHFR) делает их неспособными использовать путь de novo и становиться полностью ауксотрофными по нуклеиновым кислотам , что требует дополнительных добавок для выживания.

Селективная культуральная среда называется средой HAT, поскольку она содержит гипоксантин , аминоптерин и тимидин . Эта среда является селективной для слитых ( гибридомных ) клеток. Неслитые миеломные клетки не могут расти, потому что они лишены HGPRT и, следовательно, не могут реплицировать свою ДНК. Неслитые клетки селезенки не могут расти бесконечно из-за их ограниченной продолжительности жизни. Только слитые гибридные клетки, называемые гибридомами, способны бесконечно расти в среде, потому что партнер клетки селезенки поставляет HGPRT, а партнер миеломы имеет черты, которые делают его бессмертным (подобно раковым клеткам).

Затем эту смесь клеток разбавляют и выращивают клоны из одиночных родительских клеток в лунках для микротитрования. Затем антитела, секретируемые различными клонами, анализируют на их способность связываться с антигеном (с помощью теста, такого как ELISA или анализ микроматрицы антигена) или иммунодот- блоттинга . Затем выбирается наиболее продуктивный и стабильный клон для использования в будущем.

Гибридомы можно выращивать неограниченное время в подходящей среде для культивирования клеток. Их также можно вводить мышам (в брюшную полость , окружающую кишечник). Там они производят опухоли, выделяющие богатую антителами жидкость, называемую асцитной жидкостью.

Среда должна быть обогащена во время отбора in vitro, чтобы еще больше способствовать росту гибридомы. Это может быть достигнуто за счет использования слоя питающих фиброцитов или дополнительной среды, такой как бриклон. Можно использовать культуральные среды, кондиционированные макрофагами. Производство в культуре клеток обычно является предпочтительным, поскольку метод асцита болезнен для животного. Если существуют альтернативные методы, асцит считается неэтичным .

Новая технология разработки mAb

Недавно было разработано несколько технологий моноклональных антител, таких как фаговый дисплей , культура единичных В-клеток, амплификация единичных клеток из различных популяций В-клеток и технологии исследования единичных плазматических клеток. В отличие от традиционной гибридомной технологии, новые технологии используют методы молекулярной биологии для амплификации тяжелых и легких цепей генов антител с помощью ПЦР и получения в системах бактерий или млекопитающих с помощью рекомбинантной технологии. Одно из преимуществ новых технологий применимо к нескольким животным, таким как кролик, лама, курица и другие обычные экспериментальные животные в лаборатории.

Очищение

После получения образца среды культивированных гибридом или образца асцитной жидкости необходимо экстрагировать желаемые антитела. Загрязнения образцов клеточной культуры состоят в основном из компонентов среды, таких как факторы роста, гормоны и трансферрины . Напротив, образец in vivo может содержать антитела, протеазы , нуклеазы , нуклеиновые кислоты и вирусы хозяина . В обоих случаях могут присутствовать другие выделения гибридом, такие как цитокины . Также может быть бактериальное заражение и, как следствие, эндотоксины , выделяемые бактериями. В зависимости от сложности среды, необходимой для культивирования клеток, и, следовательно, контаминантов, тот или иной метод ( in vivo или in vitro ) может быть предпочтительным.

Образец сначала кондиционируется или готовится к очистке. Клетки, клеточный дебрис, липиды и свернувшийся материал сначала удаляются, как правило, центрифугированием с последующей фильтрацией через фильтр 0,45 мкм. Эти крупные частицы могут вызвать явление, называемое засорением мембраны, на более поздних этапах очистки. Кроме того, концентрация продукта в образце может быть недостаточной, особенно в тех случаях, когда желаемое антитело продуцируется линией клеток с низким уровнем секреции. Поэтому образец концентрируется ультрафильтрацией или диализом .

Большинство заряженных примесей обычно представляют собой анионы, такие как нуклеиновые кислоты и эндотоксины. Их можно разделить с помощью ионообменной хроматографии . Либо катионом обмен хроматографии используют на достаточно низком рН , что желаемое антитело связывается с колонки в то время как анионы , протекают через, или анионообменной хроматографии используют при достаточно высоком рН , что требуемое антитело протекает через колонку , а анионы связываются с ним. Различные белки также могут быть разделены вместе с анионами на основе их изоэлектрической точки (pI). В белках изоэлектрическая точка (pI) определяется как pH, при котором белок не имеет чистого заряда. Когда pH> pI, белок имеет чистый отрицательный заряд, а когда pH <pI, белок имеет чистый положительный заряд. Например, альбумин имеет pI 4,8, что значительно ниже, чем у большинства моноклональных антител, которые имеют pI 6,1. Таким образом, при pH от 4,8 до 6,1 средний заряд молекул альбумина, вероятно, будет более отрицательным, в то время как молекулы mAb заряжены положительно, и, следовательно, их можно разделить. Трансферрин, с другой стороны, имеет pI 5,9, поэтому его нелегко разделить этим методом. Разница в pI не менее 1 необходима для хорошего разделения.

Вместо этого трансферрин можно удалить с помощью эксклюзионной хроматографии . Этот метод является одним из наиболее надежных методов хроматографии. Поскольку мы имеем дело с белками, такие свойства, как заряд и сродство, не согласованы и меняются в зависимости от pH, поскольку молекулы протонируются и депротонируются, в то время как размер остается относительно постоянным. Тем не менее, он имеет такие недостатки, как низкое разрешение, малая емкость и малое время элюирования .

Гораздо быстрее, одношаговый метод разделения является белком A / G аффинной хроматографии . Антитело избирательно связывается с белком A / G, поэтому достигается высокий уровень чистоты (обычно> 80%). Однако этот метод может быть проблематичным для антител, которые легко повредить, поскольку обычно используются суровые условия. Низкий pH может разорвать связи и удалить антитело из колонки. Помимо возможного воздействия на продукт, низкий pH может вызвать утечку самого белка A / G из колонки и его появление в элюируемом образце. Доступны буферные системы для щадящей элюции, в которых используются высокие концентрации солей, чтобы избежать воздействия на чувствительные антитела низкого pH. Стоимость также является важным фактором при использовании этого метода, поскольку иммобилизованный белок A / G является более дорогой смолой.

Для достижения максимальной чистоты за одну стадию можно выполнить аффинную очистку с использованием антигена для обеспечения специфичности антитела. В этом методе антиген, используемый для создания антитела, ковалентно присоединяется к агарозной подложке. Если антиген представляет собой пептид , он обычно синтезируется с концевым цистеином , который позволяет селективно присоединяться к белку-носителю, такому как KLH, во время развития и поддерживать очистку. Затем содержащую антитело среду инкубируют с иммобилизованным антигеном либо партиями, либо по мере того, как антитело пропускают через колонку, где оно избирательно связывается и может удерживаться, пока примеси смываются. Затем используют элюирование буфером с низким pH или более мягким буфером для элюции с высоким содержанием соли для извлечения очищенного антитела из носителя.

Гетерогенность антител

Гетерогенность продукта является обычным явлением для моноклональных антител и других рекомбинантных биологических продуктов и обычно вводится либо выше во время экспрессии, либо ниже по потоку во время производства.

Эти варианты обычно представляют собой агрегаты, продукты дезамидирования , варианты гликозилирования , боковые цепи окисленных аминокислот, а также амино- и карбоксильные концевые аминокислоты. Эти, казалось бы, незначительные структурные изменения могут повлиять на доклиническую стабильность и оптимизацию процесса, а также на эффективность, биодоступность и иммуногенность терапевтического продукта . Общепринятый метод очистки технологических потоков моноклональных антител включает захват продукта-мишени с помощью протеина А , элюцию, подкисление для инактивации потенциальных вирусов млекопитающих с последующей ионной хроматографией , сначала с использованием анионных гранул, а затем катионных гранул.

Для идентификации и характеристики этих часто невидимых вариантов в количествах, подходящих для последующих доклинических режимов оценки, таких как фармакокинетические исследования на животных, использовалась вытесняющая хроматография . Знания, полученные на этапе доклинической разработки, имеют решающее значение для лучшего понимания качества продукции и обеспечивают основу для управления рисками и повышения гибкости регулирования. Недавняя инициатива Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов « Качество благодаря дизайну» представляет собой попытку предоставить руководство по разработке и облегчить проектирование продуктов и процессов, которые максимизируют профиль эффективности и безопасности при одновременном повышении технологичности продукта.

Рекомбинантный

Производство рекомбинантных моноклональных антител включает клонирование репертуара , CRISPR / Cas9 или технологии фагового дисплея / дрожжевого дисплея . Конструирование рекомбинантных антител включает производство антител с использованием вирусов или дрожжей , а не мышей. Эти методы основаны на быстром клонировании генных сегментов иммуноглобулина для создания библиотек антител с немного разными аминокислотными последовательностями, из которых можно выбрать антитела с желаемой специфичностью. Библиотеки фаговых антител представляют собой вариант библиотек фаговых антигенов. Эти методы можно использовать для повышения специфичности, с которой антитела распознают антигены, их стабильности в различных условиях окружающей среды, их терапевтической эффективности и их детектируемости в диагностических приложениях. Камеры ферментации использовались для крупномасштабного производства антител.

Химерные антитела

Хотя мышиные и человеческие антитела структурно схожи, различий между ними было достаточно, чтобы вызвать иммунный ответ, когда мышиные моноклональные антитела вводили человеку, что приводило к их быстрому удалению из крови, а также к системным воспалительным эффектам и выработке человеческих анти- мышиные антитела (НАМА).

Рекомбинантная ДНК изучается с конца 1980-х годов для увеличения времени пребывания. В одном подходе ДНК мыши, кодирующая связывающую часть моноклонального антитела, была слита с ДНК, продуцирующей антитела человека, в живых клетках. Экспрессия этой « химерной » или «гуманизированной» ДНК в культуре клеток давала частично мышиные, частично человеческие антитела.

Человеческие антитела

Разработаны подходы к выделению человеческих моноклональных антител.

С момента открытия возможности создания моноклональных антител ученые нацелены на создание полностью человеческих продуктов для уменьшения побочных эффектов гуманизированных или химерных антител. Было идентифицировано несколько успешных подходов: трансгенные мыши , фаговый дисплей и клонирование единичных В-клеток:

По состоянию на ноябрь 2016 года тринадцать из девятнадцати полностью человеческих терапевтических препаратов с моноклональными антителами, представленных на рынке, были получены с использованием технологии трансгенных мышей.

К числу принимающих организаций, продающих трансгенные технологии, относятся:

  • Abgenix - продавец технологии Xenomouse. Abgenix была приобретена в апреле 2006 года компанией Amgen .
  • Regeneron Pharmaceuticals VelocImmune технология.
  • Kymab - кто продает свою технологию Kymouse.
  • Откройте платформу OmniRat ™ и OmniMouse ™ компании Monoclonal Technology.
  • TRIANNI, Inc. - которые продают платформу TRIANNI Mouse.
  • Ablexis, LLC - которые продают свою платформу для мышей AlivaMab.

Фаговый дисплей можно использовать для экспрессии вариабельных доменов антител на белках оболочки нитчатого фага ( основной белок оболочки фага ). Эти антитела фагового дисплея можно использовать для различных исследовательских целей. ProAb был объявлен в декабре 1997 года и включал высокопроизводительный скрининг библиотек антител против пораженных и здоровых тканей, в то время как Proximol использовал ферментативную реакцию свободных радикалов для мечения молекул, находящихся рядом с данным белком.

Моноклональные антитела были одобрены для лечения рака , сердечно-сосудистых заболеваний , воспалительных заболеваний , дегенерации желтого пятна , отторжения трансплантата , рассеянного склероза и вирусных инфекций .

В августе 2006 года « Фармацевтические исследования и производители Америки» сообщили, что у американских компаний было 160 различных моноклональных антител, находящихся в клинических испытаниях или ожидающих одобрения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов .

Расходы

Моноклональные антитела дороже в производстве, чем небольшие молекулы, из-за сложных процессов и общего размера молекул, а также огромных затрат на исследования и разработки, связанных с предоставлением пациентам нового химического соединения. Цены на них позволяют производителям окупить обычно большие инвестиционные затраты, а там, где нет контроля над ценами, например в США, цены могут быть выше, если они обеспечивают большую ценность. Семь исследователей из Питтсбургского университета пришли к выводу: «Годовая цена терапии с применением mAb примерно на 100 000 долларов выше в онкологии и гематологии, чем при других болезненных состояниях», сравнивая их на уровне пациента с ценами на сердечно-сосудистые или метаболические нарушения, иммунологию, инфекционные заболевания. аллергия и офтальмология.

Приложения

Диагностические тесты

После получения моноклональных антител к данному веществу их можно использовать для обнаружения присутствия этого вещества. Белки можно обнаружить с помощью тестов вестерн-блоттинга и иммунодот- блоттинга . В иммуногистохимии моноклональные антитела могут использоваться для обнаружения антигенов в фиксированных срезах ткани, и аналогично иммунофлуоресценция может использоваться для обнаружения вещества либо в замороженных срезах ткани, либо в живых клетках.

Аналитическое и химическое использование

Антитела также можно использовать для очистки их целевых соединений от смесей, используя метод иммунопреципитации .

Терапевтическое использование

Терапевтические моноклональные антитела действуют посредством множества механизмов, таких как блокирование функций целевой молекулы, индукция апоптоза в клетках, экспрессирующих мишень, или путем модуляции сигнальных путей.

Лечение рака

Одно возможное лечение рака включает моноклональные антитела, которые связываются только с антигенами, специфичными для раковых клеток, и вызывают иммунный ответ против целевой раковой клетки. Такие mAb можно модифицировать для доставки токсина , радиоизотопа , цитокина или другого активного конъюгата или для создания биспецифических антител, которые могут связываться с их участками Fab как с целевым антигеном, так и с конъюгатом или эффекторной клеткой. Каждое интактное антитело может связываться с клеточными рецепторами или другими белками с помощью своей Fc-области .

Моноклональные антитела против рака. ADEPT , ферментная пролекарственная терапия, направляемая антителами; ADCC : антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; CDC: комплемент-зависимая цитотоксичность ; MAb: моноклональное антитело; scFv, одноцепочечный фрагмент Fv.

MAb, одобренные FDA для лечения рака, включают:

Аутоиммунные заболевания

Моноклональные антитела, используемые при аутоиммунных заболеваниях, включают инфликсимаб и адалимумаб , которые эффективны при ревматоидном артрите , болезни Крона , язвенном колите и анкилозирующем спондилите благодаря своей способности связываться с TNF-α и ингибировать его . Базиликсимаб и даклизумаб ингибируют IL-2 на активированных Т-клетках и тем самым помогают предотвратить острое отторжение трансплантатов почек. Омализумаб ингибирует человеческий иммуноглобулин E (IgE) и полезен при лечении аллергической астмы от умеренной до тяжелой .

Примеры терапевтических моноклональных антител

Моноклональные антитела для исследовательских целей можно найти непосредственно у поставщиков антител или с помощью специальной поисковой системы, такой как CiteAb . Ниже приведены примеры клинически важных моноклональных антител.

Основная категория Тип заявка Механизм / цель Режим
Анти-
воспалительное
инфликсимаб ингибирует TNF-α химерный
адалимумаб ингибирует TNF-α человек
устекинумаб блокирует интерлейкин IL-12 и IL-23 человек
базиликсимаб
  • острый отказ от трансплантации почек
ингибирует IL-2 на активированных Т-клетках химерный
даклизумаб
  • острый отказ от трансплантации почек
ингибирует IL-2 на активированных Т-клетках очеловеченный
омализумаб
  • аллергическая астма средней и тяжелой степени
ингибирует человеческий иммуноглобулин E (IgE) очеловеченный
Противораковые гемтузумаб нацеливает миелоидный клеточный поверхностный антиген CD33 на лейкозные клетки очеловеченный
алемтузумаб нацеливает антиген CD52 на Т- и В-лимфоциты очеловеченный
ритуксимаб нацеливает фосфопротеин CD20 на В-лимфоциты химерный
трастузумаб
  • рак груди со сверхэкспрессией HER2 / neu
нацелен на рецептор HER2 / neu (erbB2) очеловеченный
нимотузумаб Ингибитор EGFR очеловеченный
цетуксимаб Ингибитор EGFR химерный
бевацизумаб и ранибизумаб ингибирует VEGF очеловеченный
Противораковые и противовирусные бавитуксимаб иммунотерапия , нацелена на фосфатидилсерин химерный
Противовирусное средство

касиривимаб / имдевимаб

иммунотерапия , нацелена на спайк-белок SARS-CoV-2 химерный
бамланивимаб / этесевимаб иммунотерапия , нацелена на спайк-белок SARS-CoV-2 химерный
Другой паливизумаб
  • Инфекции RSV у детей
ингибирует слитый белок RSV (F) очеловеченный
абциксимаб ингибирует рецептор GpIIb / IIIa на тромбоцитах химерный

Побочные эффекты

Некоторые моноклональные антитела, такие как бевацизумаб и цетуксимаб , могут вызывать различные побочные эффекты. Эти побочные эффекты можно разделить на общие и серьезные.

Некоторые общие побочные эффекты включают:

  • Головокружение
  • Головные боли
  • Аллергии
  • Понос
  • Кашель
  • Высокая температура
  • Зуд
  • Боль в спине
  • Общая слабость
  • Потеря аппетита
  • Бессонница
  • Запор

Среди возможных серьезных побочных эффектов:

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки