Хроматография гидрофильного взаимодействия - Hydrophilic interaction chromatography

Хроматография гидрофильного взаимодействия (или жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия , HILIC ) представляет собой вариант нормально-фазовой жидкостной хроматографии, которая частично перекрывается с другими хроматографическими приложениями, такими как ионная хроматография и обращенно-фазовая жидкостная хроматография . HILIC использует гидрофильные неподвижные фазы с элюентами с обращенной фазой . Название было предложено доктором Эндрю Альпертом в его статье 1990 года по этому вопросу. Он описал хроматографический механизм для этого как жидкостно-жидкостную распределительную хроматографию, при которой аналиты элюируются в порядке возрастающей полярности, вывод, подтвержденный обзором и переоценкой опубликованных данных.

Полезный диапазон техники перегородок HILIC

Поверхность

Для разделения HILIC может использоваться любая полярная хроматографическая поверхность. Даже неполярные связанные диоксиды кремния использовались с чрезвычайно высоким составом органических растворителей, когда диоксид кремния, используемый для хроматографических сред, был особенно полярным. За этим исключением фазы HILIC можно разделить на пять категорий нейтральных полярных или ионных поверхностей:

Мобильная фаза

Типичная мобильная фаза для HILIC-хроматографии включает ацетонитрил («MeCN», также обозначаемый как «ACN») с небольшим количеством воды. Однако можно использовать любой апротонный растворитель, смешивающийся с водой (например, ТГФ или диоксан ). Также можно использовать спирты, однако их концентрация должна быть выше для достижения такой же степени удерживания аналита по сравнению с комбинацией апротонный растворитель - вода. См. Также водную нормальную фазовую хроматографию.

Обычно считается, что в HILIC подвижная фаза образует богатый водой слой на поверхности полярной неподвижной фазы по сравнению с подвижной фазой с дефицитом воды , создавая систему экстракции жидкость / жидкость. Аналят распределяются между этими двумя слоями. Однако HILIC - это больше, чем просто разделение, и включает в себя взаимодействия доноров водорода между нейтральными полярными частицами, а также слабые электростатические механизмы в условиях высокого содержания органических растворителей, используемых для удерживания. Это отличает HILIC как механизм, отличный от ионообменной хроматографии . Более полярные соединения будут иметь более сильное взаимодействие со стационарным водным слоем, чем менее полярные соединения . Таким образом, происходит разделение на основе полярности соединения и степени сольватации.

Добавки

Ионные добавки, такие как ацетат аммония и формиат аммония, обычно используются для регулирования pH подвижной фазы и силы ионов. В HILIC они также могут влиять на полярность аналита, приводя к дифференциальным изменениям в удерживании. Для чрезвычайно полярных аналитов (например, аминогликозидных антибиотиков ( гентамицин ) или аденозинтрифосфата ) требуются более высокие концентрации буфера (около 100 мМ), чтобы гарантировать, что аналит будет в единственной ионной форме. В противном случае будут наблюдаться асимметричная форма пика, хроматографические хвосты и / или плохое извлечение из стационарной фазы. Для разделения нейтральных полярных аналитов (например, углеводов) буфер не требуется.

Использование других солей, таких как 100-300 мМ перхлората натрия, которые растворимы в смесях с высоким содержанием органических растворителей (примерно 70-90% ацетонитрила ), можно использовать для увеличения полярности подвижной фазы, чтобы повлиять на элюирование. Эти соли нелетучие, поэтому этот метод менее полезен с масс-спектрометром в качестве детектора. Обычно градиента (в сторону увеличения количества воды) достаточно для ускорения элюирования.

Все ионы до некоторой степени разделяются на стационарную фазу, поэтому время от времени требуется «промывание» водой для обеспечения воспроизводимой стационарной фазы.

Приложения

Режим разделения HILIC широко используется для разделения некоторых биомолекул , органических и некоторых неорганических молекул по разнице в полярности. Его полезность увеличилась благодаря упрощенной пробоподготовке для биологических образцов при анализе метаболитов, поскольку метаболический процесс обычно приводит к добавлению полярных групп для усиления выведения из клеточной ткани. Этот метод разделения также особенно подходит для анализа гликозилирования и обеспечения качества гликопротеинов и гликоформ в биологических медицинских продуктах . Для обнаружения полярных соединений с использованием масс-спектрометрии с электрораспылением и ионизацией в качестве хроматографического детектора HILIC может предложить десятикратное повышение чувствительности по сравнению с обращенно-фазовой хроматографией, поскольку органический растворитель намного более летуч.

Выбор pH

Если химический состав поверхности является слабоионным, выбор pH может повлиять на ионный характер химического состава колонки. Правильно отрегулированный, pH может быть установлен для снижения селективности по отношению к функциональным группам с таким же зарядом, что и колонка, или повышения ее для противоположно заряженных функциональных групп. Точно так же выбор pH влияет на полярность растворенных веществ. Однако для химического состава поверхности колонки, который является сильно ионным и, следовательно, устойчивым к значениям pH в среднем диапазоне шкалы pH (pH 3,5-8,5), такое разделение будет отражать полярность только аналитов и, следовательно, может быть легче понять при разработке методов.

ЭРЛИКА

В 2008 году Альперт ввел термин ERLIC (хроматография с электростатическим отталкиванием и гидрофильным взаимодействием) для разделения HILIC, где химия поверхности ионной колонки используется для отталкивания общей ионной полярной группы на анализируемом веществе или в наборе аналитов, чтобы облегчить разделение посредством остальные полярные группы. Электростатические эффекты имеют на порядок более сильный химический потенциал, чем нейтральные полярные эффекты. Это позволяет минимизировать влияние общей ионной группы в наборе молекул аналита; или для уменьшения степени удерживания этих более полярных функциональных групп, даже обеспечивая изократическое разделение вместо градиента в некоторых ситуациях. Его последующая публикация далее описывала эффекты ориентации, которые другие также называли нормальной фазой ионных пар или e-HILIC, отражая механизмы удерживания, чувствительные к определенной ионной части анализируемого вещества, либо притягивающему, либо отталкивающему. ЭРЛИЧЕСКОЕ (eHILIC) разделение не обязательно должно быть изократическим, но конечный эффект заключается в снижении притяжения особенно сильной полярной группы, что затем требует менее строгих условий элюирования, и усиленного взаимодействия оставшихся полярных (противоположно заряженных ионных или не -ионогенные) функциональные группы аналита (ов).

Катионный eHILIC

Например, можно использовать катионообменную (отрицательно заряженную) химию поверхности для разделения ERLIC, чтобы уменьшить влияние на удерживание анионных (отрицательно заряженных) групп (фосфатов нуклеотидов или смесей фосфонильных антибиотиков; или групп сиаловой кислоты модифицированных углеводов) чтобы теперь обеспечить разделение на основе основных и / или нейтральных функциональных групп этих молекул. Изменение полярности слабоионной группы (например, карбоксила) на поверхности легко достигается путем регулирования pH в пределах двух единиц pH от pKa этой группы. Для сильно ионных функциональных групп поверхности (например, сульфатов или фосфатов) вместо этого можно использовать меньшее количество буфера, чтобы остаточный заряд не был полностью спарен ионами. Пример этого может быть использованием 12.5MM (а не рекомендованная> 20 мМ буфера), рН 9,2 подвижной фазы на полимерном , цвиттерионный , бетаине - сульфонат поверхность отдельно фосфонили антибиотические смеси (каждый из которых содержит фосфатную группу). Это усиливает влияние функциональных групп сульфоновой кислоты на химический состав поверхности колонки на ее, слегка уменьшенный (по pH), четвертичный амин. В соответствии с этим, эти аналиты будут демонстрировать пониженное удерживание на колонке, элюирующейся раньше, и в более высоких количествах органического растворителя, чем при использовании нейтральной полярной HILIC поверхности. Это также увеличивает их чувствительность обнаружения с помощью масс-спектрометрии отрицательных ионов.

Анионный eHILIC

По аналогии с вышеизложенным, можно использовать анионообменную (положительно заряженную) химию поверхности колонки для уменьшения влияния на удерживание катионных (положительно заряженных) функциональных групп для набора аналитов, например, при селективном выделении фосфорилированных пептидов или сульфатированных молекул полисахарида . Использование pH между 1 и 2 единицами pH снизит полярность двух из трех ионизируемых атомов кислорода фосфатной группы и, таким образом, обеспечит легкую десорбцию из (противоположно заряженной) химии поверхности. Это также снизит влияние отрицательно заряженных карбоксилов в аналитах, так как они будут протонированы при таком низком значении pH и, таким образом, будут вносить меньшую общую полярность в молекулу. Любые общие положительно заряженные аминогруппы будут отталкиваться от химического состава поверхности колонки, и, таким образом, эти условия повышают роль полярности фосфата (а также других нейтральных полярных групп) в разделении.

Ссылки