Иммуноокрашивание - Immunostaining

Микрофотография из GFAP иммуноокрашивания сечения опухоли головного мозга .

В биохимии , иммунное любое использование антитела основанной методы для обнаружения конкретного белка в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания срезов тканей, как впервые было описано Альбертом Кунсом в 1941 году. Однако теперь иммуноокрашивание охватывает широкий спектр методов, используемых в гистологии , клеточной биологии и молекулярной биологии с использованием антител. методы окрашивания на основе.

Методы

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия или ИГХ-окрашивание срезов тканей (или иммуноцитохимия , которая представляет собой окрашивание клеток ), возможно, является наиболее часто применяемым методом иммуноокрашивания. В то время как первые случаи IHC окрашивания использовали флуоресцентные красители (см иммунофлюоресценции ), другие не-флуоресцентные методы , используя ферменты , такие как пероксидаза (см иммунопероксидазного окрашивание ) и щелочные фосфатазы в настоящее время используются. Эти ферменты способны катализировать реакции, в результате которых образуется окрашенный продукт, который легко обнаружить с помощью световой микроскопии . В качестве альтернативы радиоактивные элементы можно использовать в качестве меток, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиографии .

Подготовка или фиксация ткани важны для сохранения морфологии клеток и архитектуры ткани. Неправильная или продолжительная фиксация может значительно снизить способность связывания антител. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы на срезах тканей, закрепленных формалином и парафином . Однако некоторые антигены не выдерживают даже умеренной фиксации альдегида. В этих условиях ткани следует быстро заморозить в жидком азоте и разрезать с помощью криостата. К недостаткам замороженных срезов можно отнести плохую морфологию, низкое разрешение при больших увеличениях, трудности с разрезанием парафиновых срезов и необходимость хранения в замороженном виде. В качестве альтернативы, срезы вибратома не требуют обработки ткани с помощью органических растворителей или высокой температуры, которые могут разрушить антигенность, или нарушении замораживания-оттаивания. Недостатком вибратомных секций является то, что процесс секционирования медленный и трудный для мягких и плохо закрепленных тканей, и что на секциях часто видны следы вибрации или линии вибратома.

Обнаружение многих антигенов может быть значительно улучшено с помощью методов поиска антигена, которые действуют путем разрыва некоторых перекрестных связей белков, образованных при фиксации, для обнаружения скрытых антигенных сайтов. Это может быть достигнуто путем нагревания в течение разного времени (извлечение эпитопа, индуцированного нагреванием или HIER) или с использованием ферментного расщепления (извлечение эпитопа, индуцированного протеолитами, или PIER).

Одной из основных трудностей при окрашивании ИГХ является преодоление специфического или неспецифического фона. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация промывочных буферов и времени промывки после антител - все это важно для получения высококачественного иммунного окрашивания. Кроме того, для определения специфичности важно наличие положительного и отрицательного контролей для окрашивания.

Проточной цитометрии

Цитометра поток может быть использована для прямого анализа клеток , экспрессирующих один или несколько специфических белков. Клетки иммуноокрашивают в растворе с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для иммунофлуоресценции, а затем анализируют проточной цитометрией.

Проточная цитометрия имеет ряд преимуществ перед ИГХ, включая: способность определять отдельные популяции клеток по их размеру и гранулярности; способность удалять мертвые клетки; повышенная чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективной при обнаружении чрезвычайно редких популяций клеток, и при отсутствии среза ткани происходит потеря архитектурных отношений. Проточная цитометрия также требует высоких капитальных затрат, связанных с покупкой проточного цитометра.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать определенные белки из экстрактов, полученных из клеток или тканей, до или после любых этапов очистки . Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза перед переносом на синтетическую мембрану с помощью методов сухого, полусухого или влажного блоттинга. Затем мембрану можно зондировать с помощью антител, используя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Обнаружение обычно выполняется с использованием антител, связанных с пероксидазой, для катализа хемилюминесцентной реакции.

Вестерн-блоттинг - это стандартный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка в экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет измерить молекулярную массу белка по сравнению с известными маркерами молекулярной массы.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ или ELISA - это диагностический метод для количественного или полуколичественного определения концентраций белка из плазмы крови , сыворотки или экстрактов клеток / тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В целом белки в растворе адсорбируются на планшетах для ELISA. Антитела, специфичные к интересующему белку, используются для зондирования планшета. Фон сводится к минимуму за счет оптимизации методов блокирования и промывки (как для ИГХ), а специфичность обеспечивается за счет наличия положительных и отрицательных контролей. Методы обнаружения обычно основаны на колориметрии или хемилюминесценции.

Иммуно-электронная микроскопия

Электронную микроскопию или ЭМ можно использовать для детального изучения микроархитектуры тканей или клеток. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золотом), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии . Несмотря на то, что иммуно-ЭМ эффективен в обнаружении субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогим и требовать строгой оптимизации методов фиксации и обработки ткани. Было предложено биотинилирование белков in vivo для облегчения проблем, вызванных частой несовместимостью окрашивания антител с протоколами фиксации, которые лучше сохраняют морфологию клеток.

Методологический обзор

В методах иммуноокрашивания антитело используется для обнаружения специфического белкового эпитопа . Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными . Обнаружение этого первого или первичного антитела может осуществляться несколькими способами.

Первичное антитело можно непосредственно пометить с помощью фермента или флуорофора .
Первичное антитело можно пометить с помощью небольшой молекулы, которая взаимодействует с партнером по связыванию с высоким сродством, который может быть связан с ферментом или флуорофором. Биотин - стрептавидин является одним широко используемым взаимодействием с высоким сродством.
Первичное антитело можно исследовать на предмет использования более широкого видоспецифичного вторичного антитела , которое помечено с помощью фермента или флуорофора.
В случае электронной микроскопии антитела связаны с частицами тяжелого металла (обычно с наночастицами золота диаметром 5-15 нм).

Как было описано ранее, ферменты , такими как хрена пероксидаза или щелочная фосфатаза обычно используется для катализа реакций , которые дают цветной или хемилюминесцентный продукт. Флуоресцентные молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной микроскопии .

Приложения

Применения иммуноокрашивания многочисленны, но чаще всего они используются в клинической диагностике и лабораторных исследованиях .

Клинически ИГХ используется в гистопатологии для диагностики определенных типов рака на основе молекулярных маркеров.

В лабораторных исследованиях иммуноокрашивание может использоваться для множества применений, основанных на исследовании наличия или отсутствия белка, его тканевого распределения, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.

Languages

In other projects