Нокаут-мышь - Knockout mouse

Нокаута мыши , или нокаут - мыши , является генетически модифицированной мыши ( Mus Musculus ) , в которых исследователи инактивируется, или « нокаут », существующий ген , заменив его или нарушить его с искусственным кусок ДНК . Они являются важными моделями животных для изучения роли генов, которые были секвенированы, но функции которых не определены. Вызывая неактивность определенного гена у мыши и наблюдая любые отличия от нормального поведения или физиологии, исследователи могут сделать вывод о его вероятной функции.

В настоящее время мыши являются лабораторными животными, наиболее близкими к людям, и к которым легко применить метод нокаута. Они широко используются в экспериментах с нокаутом, особенно при исследовании генетических вопросов, связанных с физиологией человека . Нокаут генов у крыс намного сложнее и стал возможен только с 2003 года.

Первая зарегистрированная мышь с нокаутом была создана Марио Р. Капеччи , Мартином Эвансом и Оливером Смитисом в 1989 году, за что они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года . Некоторые аспекты технологии создания мышей-нокаутов и сами мыши были запатентованы во многих странах частными компаниями.

Использовать

Рядом с нормальной лабораторной мышью показана лабораторная мышь, у которой был отключен ген, влияющий на рост волос (слева).

Выключение активности гена дает информацию о том, что этот ген обычно делает. У людей много общих генов с мышами. Следовательно, наблюдение за характеристиками мышей с нокаутом дает исследователям информацию, которая может быть использована для лучшего понимания того, как подобный ген может вызывать или способствовать заболеванию у людей.

Примеры исследований, в которых были полезны нокаутные мыши, включают изучение и моделирование различных видов рака , ожирения , сердечных заболеваний , диабета , артрита , злоупотребления психоактивными веществами , беспокойства , старения и болезни Паркинсона . Нокаут-мыши также представляют собой биологический и научный контекст, в котором могут быть разработаны и испытаны лекарства и другие методы лечения.

Ежегодно в экспериментах используются миллионы мышей с нокаутом.

Штаммы

Нокаутирующая мышь (слева), которая является моделью ожирения по сравнению с нормальной мышью.

Существует несколько тысяч различных линий нокаутных мышей. Многие модели мышей названы в честь инактивированного гена. Например, мышь с нокаутом p53 названа в честь гена p53, который кодирует белок, который обычно подавляет рост опухолей путем остановки деления клеток и / или индукции апоптоза. Люди, рожденные с мутациями, деактивирующими ген p53, страдают синдромом Ли-Фраумени , состоянием, которое резко увеличивает риск развития рака костей, рака груди и рака крови в раннем возрасте. Другие модели мышей названы в соответствии с их физическими характеристиками или поведением.

Процедура

Процедура изготовления бластоцисты смешанного генотипа.
Схема разведения для получения нокаутных мышей. Бластоцисты, содержащие клетки как дикого типа, так и клетки нокаута, вводятся в матку приемной матери. Это дает потомство либо дикого типа, окрашенного в тот же цвет, что и донор бластоцисты (серый), либо химеры (смешанные) и частично выбитые. Мышей-химер скрещивают с нормальной мышью дикого типа (серый цвет). Это дает потомство, которое является либо белым и гетерозиготным по нокаутированному гену, либо серым и диким типом. Белых гетерозиготных мышей впоследствии можно скрещивать с получением мышей, гомозиготных по нокаутированному гену.

Существует несколько вариантов процедуры получения мышей с нокаутом; Ниже приводится типичный пример.

  1. Выключаемый ген выделяют из библиотеки генов мыши . Затем конструируется новая последовательность ДНК, которая очень похожа на исходный ген и его ближайшую соседнюю последовательность, за исключением того, что она достаточно изменена, чтобы ген стал неработоспособным. Обычно новой последовательности также присваивается ген-маркер , ген, которого нет у нормальных мышей и который придает устойчивость к определенному токсическому агенту (например, неомицину) или вызывает наблюдаемые изменения (например, цвет или флуоресценцию). Кроме того, второй ген, такой как tk + герпеса, также включен в конструкцию для выполнения полного отбора.
  2. Эмбриональные стволовые клетки выделяют из бластоцисты мыши (очень молодого эмбриона ) и выращивают in vitro . Для этого примера мы возьмем стволовые клетки от белой мыши.
  3. Новая последовательность из шага 1 вводится в стволовые клетки из шага 2 путем электропорации . В результате естественного процесса гомологичной рекомбинации некоторые из электропорированных стволовых клеток будут включать новую последовательность с выключенным геном в свои хромосомы вместо исходного гена. Шансы на успешное событие рекомбинации относительно низки, поэтому большинство измененных клеток будет иметь новую последовательность только в одной из двух соответствующих хромосом - они считаются гетерозиготными . Клетки, трансформированные вектором, содержащим ген устойчивости к неомицину и ген tk + герпеса, выращивают в растворе, содержащем неомицин и ганцикловир, для отбора трансформаций, произошедших посредством гомологичной рекомбинации. Любая вставка ДНК, которая произошла путем случайной вставки, погибнет, потому что они дают положительный результат как на ген устойчивости к неомицину, так и на ген герпеса tk +, продукт гена которого реагирует с ганцикловиром с образованием смертельного токсина. Более того, клетки, которые не интегрируют какой-либо генетический материал, дают отрицательный результат на оба гена и поэтому умирают в результате отравления неомицином.
  4. Эмбриональные стволовые клетки, в которые включен нокаутный ген, выделяют из неизмененных клеток с использованием маркерного гена со стадии 1. Например, неизмененные клетки могут быть уничтожены с использованием токсичного агента, к которому измененные клетки устойчивы.
  5. Нокаутированные эмбриональные стволовые клетки с шага 4 вставляют в бластоцисту мыши . В этом примере мы используем бластоцисты серой мыши. Бластоцисты теперь содержат два типа стволовых клеток: исходные (от серой мыши) и нокаутированные клетки (от белой мыши). Эти бластоцисты затем имплантируются в матку самок мышей, где они развиваются. Таким образом, новорожденные мыши будут химерами : некоторые части их тел являются результатом исходных стволовых клеток, другие части - поврежденными стволовыми клетками. На их мехе будут пятна белого и серого цвета, с белыми пятнами, полученными от нокаутированных стволовых клеток, и серыми пятнами от бластоцисты-реципиента.
  6. Некоторые из новорожденных мышей-химер будут иметь гонады, полученные из нокаутированных стволовых клеток, и, следовательно, будут производить яйцеклетки или сперматозоиды, содержащие нокаутный ген. Когда этих химерных мышей скрещивают с другими мышами дикого типа, у некоторых из их потомков будет одна копия нокаутированного гена во всех их клетках. Эти мыши не сохраняют ДНК серых мышей и не являются химерами, однако они все еще гетерозиготны.
  7. Когда эти гетерозиготные потомки скрещиваются, некоторые из их потомков унаследуют нокаутный ген от обоих родителей; они не несут функциональной копии исходного неизмененного гена (т.е. они гомозиготны по этому аллелю).

Подробное объяснение того, как создаются нокаутные (KO) мыши, можно найти на веб-сайте Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года.

Ограничения

Национальный институт здоровья обсуждает некоторые важные ограничения этого метода.

Хотя технология нокаутирующих мышей представляет собой ценный исследовательский инструмент, существуют некоторые важные ограничения. Около 15 процентов нокаутов генов являются смертельными для развития, что означает, что генетически измененные эмбрионы не могут вырасти во взрослых мышей. Эту проблему часто преодолевают с помощью условных мутаций . Отсутствие взрослых мышей ограничивает исследования эмбриональным развитием и часто затрудняет определение функции гена в отношении здоровья человека . В некоторых случаях ген может выполнять другую функцию у взрослых, чем у развивающихся эмбрионов.

Нокаут гена также может не привести к наблюдаемым изменениям у мыши или может даже дать характеристики, отличные от тех, которые наблюдаются у людей, у которых тот же ген инактивирован. Например, мутации в гене p53 связаны с более чем половиной случаев рака человека и часто приводят к опухолям в определенном наборе тканей. Однако, когда ген p53 отключен у мышей, у животных развиваются опухоли в другом массиве тканей.

Процедура в целом отличается в зависимости от штамма, из которого были получены стволовые клетки. Обычно используются клетки, полученные из штамма 129. Этот специфический штамм не подходит для многих экспериментов (например, поведенческих), поэтому очень часто происходит обратное скрещивание потомства с другими штаммами. Было доказано, что некоторые геномные локусы очень трудно выбить. Причины могут быть в наличии повторяющихся последовательностей, обширном метилировании ДНК или гетерохроматине . Смешивающее присутствие соседних 129 генов в нокаутном сегменте генетического материала было названо «эффектом фланкирующего гена». Были предложены методы и рекомендации для решения этой проблемы.

Другое ограничение состоит в том, что обычные (т.е. не обусловленные условием) мыши с нокаутом развиваются в отсутствие исследуемого гена. Иногда потеря активности во время развития может маскировать роль гена во взрослом состоянии, особенно если ген участвует во многих процессах, охватывающих развитие. Затем требуются подходы с условной / индуцибельной мутацией, которые сначала позволяют мыши нормально развиваться и созревать до удаления интересующего гена.

Другим серьезным ограничением является отсутствие эволюционных адаптаций в модели нокаута, которые могут иметь место у животных дикого типа после того, как они естественным образом мутируют. Так , например, в эритроцитах конкретных коэкспрессия GLUT1 с stomatin представляет собой компенсаторный механизм у млекопитающих, которые не способны синтезировать витамин С .

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки