LNCaP - LNCaP
Клетки LNCaP представляют собой линию клеток человека, обычно используемую в области онкологии . Клетки LNCaP представляют собой андроген- чувствительные клетки аденокарциномы предстательной железы человека, полученные из метастазов левого надключичного лимфатического узла у 50-летнего мужчины европеоидной расы в 1977 году. Они представляют собой прикрепленные эпителиальные клетки, растущие как агрегаты, так и отдельные клетки.
Одним из основных препятствий для проведения наиболее клинически значимых исследований рака простаты (РПЖ) было отсутствие клеточных линий, которые точно имитируют прогрессирование заболевания человека. Двумя отличительными чертами метастатического рака предстательной железы человека являются переход агрессивного РПЖ от андрогенной чувствительности к состоянию нечувствительности к андрогенам (НЧ) и склонность РПЖ к метастазам в кости. Хотя создание клеточных линий AI было довольно успешным, что продемонстрировано на «классических» клеточных линиях DU145 и PC3 , поведение этих клеток в кости не полностью имитирует клиническое заболевание человека. Хорошо известно, что метастазы РПЖ в кости человека образуют остеобластические поражения, а не остеолитические поражения, наблюдаемые при других видах рака, таких как рак груди. Точно так же клетки PC-3 и DU145 образуют остеолитические опухоли. Для разработки модели клеток AI-PCa, которая более точно имитирует клиническое заболевание, были созданы сублинии LNCaP, которые на сегодняшний день являются наиболее клинически значимыми инструментами для культивирования тканей.
История
LNCaP ( л ymph Н оде Са rcinoma из Р rostate) клеточной линии была установлена с метастатическим поражением аденокарциномы предстательной железы человека. Клетки LNCaP легко растут in vitro (до 8 x 10 5 клеток / кв. См; время удвоения 60 часов), образуют клоны и обладают высокой устойчивостью к интерферону фибробластов человека . Клетки LNCaP имеют модальное число хромосом от 76 до 91, что свидетельствует о мужском кариотипе человека с несколькими маркерными хромосомами . Злокачественные свойства клеток LNCaP сохраняются у бестимусных голых мышей, у которых развиваются опухоли в месте инъекции и наблюдается аналогичное время удвоения in vivo .
В цитозольной и ядерной фракциях присутствуют специфические рецепторы андрогенов и эстрогенов с высокой аффинностью . Линия LNCaP гормонально чувствительна, что подтверждается модуляцией 5-альфа-дигидротестостероном in vitro клеточного роста и продукции кислой фосфатазы. Клетки LNCaP также экспрессируют специфический антиген простаты (PSA). In vivo у самцов мышей опухоли развиваются раньше и чаще, чем у самок, и гормональные манипуляции показывают, что частота развития опухолей коррелирует с уровнями андрогенов в сыворотке. Однако скорость роста опухоли не зависит от пола или гормонального статуса хозяина.
C4 / C5 и C4-2
Wu et al. (1994) воспроизвели человеческие опухоли LNCaP у мышей с ослабленным иммунитетом путем совместной инъекции клеток LNCaP с костными фибробластами человека MS. Клетки вводили подкожно в несколько участков на бок мыши, и примерно через 4 недели роста опухоли легко обнаруживались при физикальном осмотре и имели высокую скорость роста (17-33 мм3 / день).
Чтобы воспроизвести характерный сдвиг клеток РПЖ в AI, мышей-хозяев LNCaP кастрировали посредством среднего разреза мошонки примерно через 8 недель после инъекции. Опухоли сохраняли у кастрированных хозяев в течение 4-5 недель, после чего собирали оставшиеся опухоли. Всего у кастрированных хозяев были собраны два подмножества клеток: C4 и C5, собранные на 4 и 5 неделях соответственно.
Для дальнейшего отбора клеток AI-PCa подлинию C4 инъецировали совместно с человеческими фибробластами MS кастрированному хозяину. Полученные опухоли были изолированы, и была создана дополнительная подлиния C4-2.
Сравнение кариотипов показывает, что клетки LNCaP, выращенные в интактных хозяевах (подлиния M), имеют модальное число хромосомного распределения 83, подлиния C4 и C5 - 85, а подлиния C4-2 - 83.
Для дополнительной проверки того, что эти клетки были человеческого происхождения, анализ кариотипа определил, что родительские клетки LNCaP имели 7 различных маркерных хромосом, по две копии каждой. Подлиния M, C4, C5 и C4-2 содержали большинство маркерных хромосом, при этом подлиния M наиболее сходна с родительскими клетками LNCaP. C4, C5 и C4-2 лишь незначительно отличаются от LNCaP и M-подлинии с добавлением маркерной хромосомы в результате добавления сегмента к хромосоме 6. Y-хромосома отсутствует в большинстве клеток C4, C5 и C4-2, предполагая серьезные хромосомные изменения.
Сублинии C4, C5 и C4-2 хорошо растут в тех же условиях культивирования тканей, что и LNCaP, с аналогичной скоростью роста. Родительская подлиния LNCaP, M, C4 и C5 имеет сходные базовые уровни экспрессии генов орнитиндекарбоксилазы (ODC) и специфического антигена простаты (PSA), однако сублинии M, C4 и C5 экспрессируют в 5-10 раз больше мРНК PSA. M, C4, C5 и C4-2 также экспрессировали уменьшенную мРНК рецептора андрогенов человека, как и ожидалось в клетках AI.
Нечувствительность к андрогенам. Все сублинии обрабатывались дигидротестостероном (DHT), лигандом с высоким сродством к AR. Обработка DHT вызвала заметное снижение роста клеток C4 и C5 и отсутствие роста клеток C4-2 по сравнению с высокой скоростью роста, наблюдаемой в клетках LNCaP, что предполагает снижение чувствительности к андрогенам в клетках C4 и C5 и AI в клетках C4-2. Анализ AR целых клеток также показал, что клетки LNCaP имеют гораздо более высокую аффинную форму AR (Kd = 159 пМ) по сравнению с C4-2 (Kd = 267 пМ).
Онкогенность Сублинии C4 и C5 проявляют значительно повышенную онкогенность при введении интактным самцам мышей, в отличие от родительских клеток LNCaP. C4 и C5 также были способны образовывать карциномы с высокой степенью васкуляризации у кастрированных мышей при совместной инъекции с человеческими фибробластами MS. Подлиния C4-2 более легко образует опухоли у интактных хозяев, чем сублинии C4 и C5, и они являются единственными клетками, способными образовывать опухоли у кастрированного хозяина без совместной инъекции человеческих костных фибробластов MS. Эти же опухоли C4-2 окрашивались на PSA и секретировали высокие уровни PSA в питательную среду.
C4-2B
Для создания сублинии метастазов в кости клетки C4-2 ортотопически вводили кастрированным самцам мышей. Эти клетки сформировали большие первичные опухоли простаты, лимфатических узлов, а также опухоли костей. Выделение этих опухолей костей привело к получению сублинии C4-2B. Клетки C4-2B были положительными на ПСА и цитокератин 8 , что подтверждает их простатическое происхождение. Наиболее важно, что иммуногистохимическое окрашивание опухолей C4-2B было положительным в отношении активности остеобластов, что свидетельствует об индукции образования остеобластических опухолей, отражающих прогрессирование РПЖ у человека.
При культивировании в «проминерализационной среде», содержащей аскорбиновую кислоту (которая, как известно, способствует формированию скелетоподобных ECM в остеобластах) и источник фосфата (для образования гидроксиапатита ), клетки C4-2B продуцируют и удерживают примерно в 8 раз больше минерализованного кальция, чем исходный LNCaP. клетки. Клетки C4-2B также экспрессируют более высокие уровни мРНК остеопротегерина (OPG), щелочной фосфатазы , костного сиалопротеина (BSP), остеокальцина (OCN), RANKL и остеонектина (OSN), все из которых в высокой степени экспрессируются остеобластами . Активность промотора остеобластов также выше в клетках C4-2B по сравнению с LNCaP, на что указывает экспрессия фактора транскрипции Cbfa1 . В то же время, BMP7 , известный индуктор Cbfa1, также более высоко экспрессируется в клетках C4-2B, что дополнительно указывает на многие свойства, подобные остеобластам.
Независимые от андрогенов варианты
Клетки LN95 были получены из LNCaP, культивированного в RPMI-1640 (без фенолового красного) с 10% очищенной от угля фетальной бычьей сывороткой. Клетки LN95 отличаются от родительских клеток LNCaP морфологически, с выраженными дендритными расширениями, и молекулярно, экспрессией варианта рецептора андрогена, аналогичной экспрессии клеток AR-V7 High VCaP . Примечательно, что клетки LN95 значительно чаще инициируют опухоли, чем их родительские аналоги in vivo .
Клетки LNCaP-AI (или LN-AI) получали из 6-месячной культуры родительских клеток LNCaP в сыворотке, очищенной от угля. Хотя LNCaP-AI полностью независимы от андрогенов, они сохраняют высокую экспрессию рецептора андрогенов , низкую экспрессию AR-V7 и остаются чувствительными к андрогенам. Механизм высокопролиферативного фенотипа клеток LNCaP-AI, по-видимому, заключается в потере экспрессии регулятора клеточного цикла (p21, p16) и повышенной экспрессии антиапоптотического Bcl2 .
использованная литература
дальнейшее чтение
- Ли Х, Ловчи М.Т., Квон Ю.С., Розенфельд М.Г., Фу XD, Йео Г.В. (2008). «Определение плотности метки, необходимой для анализа цифрового транскриптома: приложение к андроген-чувствительной модели рака простаты» . Proc Natl Acad Sci USA . 105 (51): 20179–84. Bibcode : 2008PNAS..10520179L . DOI : 10.1073 / pnas.0807121105 . PMC 2603435 . PMID 19088194 .