Теги MS2 - MS2 tagging
Мечение MS2 - это метод, основанный на естественном взаимодействии белка оболочки бактериофага MS2 со структурой петли-ствол из генома фага , который используется для биохимической очистки комплексов РНК-белок и является партнером GFP для обнаружения РНК в живых клетках. Совсем недавно этот метод использовался для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме. Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывисто, причем всплески транскрипции разделяются нерегулярными интервалами.
Процедура
Начните с одноцепочечной РНК и создайте образец структур «стебель-петля», добавив копии РНК-связывающих последовательностей MS2 в некодирующую область. Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии РНК-связывающей последовательности MS2. Слитый белок MS2-GFP экспрессировали путем переноса его в клетку с плазмидой (лаборатория Роберта Сингера). Сигнал кодируется внутри РНК, и наличие сигнала ядерной локализации (NLS) внутри GFP-MS2 - это два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК.
Аффинная очистка РНК, меченной биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов идентификации взаимодействий белок-РНК in vivo. Экспрессировались как РНК, помеченная MS2, так и белковая метка MS2, а затем аффинное взаимодействие использовалось, чтобы помочь процессу идентификации взаимодействий белок-РНК.
Преимущества и недостатки
Преимущества:
Метод MS2-BioTRAP быстр, гибок и прост в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействия белок-РНК. Тег MS2 также эффективен для небольших молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных частиц рибонуклеопротеина (RNP) .
Недостатки:
Одно из предостережений при маркировке MS2 заключается в том, что необходимо добавить множество копий стержневой петли MS2 внутри РНК, чтобы произвести достаточно сигнала для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре. При отслеживании более одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток требуется более одной последовательности-мишени. На это может повлиять белок MS2, который имеет классический сигнал базовой ядерной локализации (NLS), поэтому он может повлиять на расположение комплекса РНК, и ядро будет иметь большую часть GFP-MS2 (лаборатория Роберта Сингера). Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к сильным сигналам ядерной флуоресценции, которые будут задерживать или предотвращать анализ ядерной локализации РНК, поскольку это затрудняет анализ сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляции РНК. Более того, из-за добавления метки вторичная структура РНК может вносить артефакт.
Кроме того, на уровни экспрессии малой некодирующей РНК (мРНК) и регуляторные свойства будет влиять метка MS2. Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в бактериях E. coli , ученые экспрессировали MS2-MBP, который представляет собой белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые со связывающими мальтозу белками . Мутации препятствовали олигомеризации .