Тест на нуклеиновую кислоту - Nucleic acid test

Ротавирус

Тест на нуклеиновую кислоту ( NAT ) - это метод, используемый для обнаружения определенной последовательности нуклеиновой кислоты и, следовательно, обычно для обнаружения и идентификации определенного вида или подвида организма, часто вируса или бактерии, которые действуют как патоген в крови , тканях , моче , и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетический материал ( РНК или ДНК ), а не антигены или антитела . Обнаружение генетических материалов позволяет ранней диагностике заболевания, поскольку для обнаружения антигенов и / или антител требуется время, чтобы они начали появляться в кровотоке. Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают этап, который усиливает генетический материал, то есть делает его множество копий. Такие NAT называются тестами амплификации нуклеиновых кислот ( NAAT ). Существует несколько способов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ замещения цепи (SDA) или анализ, опосредованный транскрипцией (TMA).

Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность спаривания оснований Уотсона-Крика ; молекулы одноцепочечного зонда или праймера захватывают молекулы-мишени ДНК или РНК комплементарных цепей . Следовательно, конструкция цепей зонда очень важна для повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Однако мутанты, которые составляют генетическую основу множества заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они различаются только одним основанием, например вставками , делециями и однонуклеотидными полиморфизмами (SNP). В этом случае легко может произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложноположительным результатам, таким как ошибочное принятие штамма, который является комменсалом, за штамм , который является патогенным. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.

Достижения

Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорной точкой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.

В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент идеально дополняет целевую последовательность. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Стандартная разность свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами для замены опоры на пальцах ног с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним значением. 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и с концентрациями нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.

После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которых также используется реакция обмена пальцами ног. Это позволило оптическое обнаружение правильной цели и цели SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.

В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции». В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, минимум 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.

Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). Это термостойкая ПЦР, которая избирательно усиливает все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, позволяя легко обнаруживать и количественно оценивать сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.

Приложения

  • Диагностика гонококковых и других инфекций Neisseria: амплификация конкретных последовательностей ДНК или РНК N. gonorrhea для обнаружения.
  • Диагностика урогенитальной инфекции C. trachomatis
  • Обнаружение микобактерий туберкулеза
  • Обнаружение РНК или ДНК ВИЧ
  • Обнаружение зоонозных коронавирусов
  • Диагностический тест на SARS-CoV-2

использованная литература