Фосфолипаза D - Phospholipase D

Фосфолипазы D ( EC 3.1.4.4 , lipophosphodiesterase II , Лецитиназа D , холина фосфатазы ) ( PLD ) представляет собой фермент из фосфолипазы надсемейства . Фосфолипазы широко распространены и могут быть обнаружены в широком спектре организмов, включая бактерии, дрожжи, растения, животных и вирусы. Основным субстратом фосфолипазы D является фосфатидилхолин , который он гидролизует с образованием сигнальной молекулы фосфатидной кислоты (PA) и растворимого холина в холестерин-зависимом процессе, называемом презентацией субстрата . Растения содержат множество генов, кодирующих различные изоферменты PLD , с молекулярной массой от 90 до 125 кДа . Клетки млекопитающих кодируют две изоформы фосфолипазы D: PLD1 и PLD2 . Фосфолипаза D играет важную роль во многих физиологических процессах, включая перенос через мембрану , реорганизацию цитоскелета , рецептор-опосредованный эндоцитоз , экзоцитоз и миграцию клеток . Благодаря этим процессам он был дополнительно вовлечен в патофизиологию множества заболеваний : в частности, в прогрессирование болезней Паркинсона и Альцгеймера , а также различных видов рака . PLD также может помочь установить порог чувствительности к анестезии и механической силе.

Открытие

Об активности типа PLD впервые сообщили в 1947 году Дональд Дж. Ханахан и И.Л. Чайкофф. Однако только в 1975 году гидролитический механизм действия был выяснен в клетках млекопитающих . Растительные изоформы PLD впервые были очищены из капусты и клещевины ; В конечном итоге PLDα был клонирован и охарактеризован из множества растений, включая рис, кукурузу и томат. PLD растений были клонированы в трех изоформах: PLDα , PLDβ и PLDγ . Более полувека биохимических исследований показали, что активность фосфолипазы D и PA участвует в широком спектре физиологических процессов и заболеваний , включая воспаление , диабет , фагоцитоз , нейрональные и сердечные сигналы и онкогенез .

Функция

Строго говоря, фосфолипаза D представляет собой трансфосфатидилазу : она опосредует обмен полярными головными группами, ковалентно присоединенными к мембраносвязанным липидам . Использование воды в качестве нуклеофильного агента , этот фермент катализирует расщепление в фосфодиэфирной связи в структурных фосфолипидов , таких как фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин . Продуктами этого гидролиза являются мембраносвязанная липидная фосфатидная кислота (PA) и холин , который диффундирует в цитозоль . Поскольку холин имеет небольшую активность вторичного мессенджера, активность PLD в основном трансформируется за счет продукции PA. PA активно участвует во внутриклеточной передаче сигнала . Кроме того, некоторые члены суперсемейства PLD могут использовать первичные спирты, такие как этанол или 1-бутанол, при расщеплении фосфолипида , эффективно катализируя обмен полярной головной группы липидов . Другие члены этого семейства способны гидролизовать другие фосфолипидные субстраты, такие как кардиолипин , или даже фосфодиэфирную связь, составляющую основу ДНК .

Фосфатидная кислота

Многие клеточные функции фосфолипазы D опосредуются ее основным продуктом, фосфатидной кислотой (PA). PA представляет собой отрицательно заряженный фосфолипид , небольшая головная группа которого способствует искривлению мембраны . Это, таким образом , как полагают, облегчить мембрану - везикулы слияние и деление в методике , аналогичной методике клатрин-опосредованного эндоцитоза . PA может также привлекать белки, которые содержат соответствующий ему связывающий домен , область, характеризующуюся областями, богатыми основными аминокислотами . Кроме того, PA может быть преобразован в ряд других липидов , таких как лизофосфатидная кислота (лизо-PA) или диацилглицерин , сигнальные молекулы, которые оказывают множество эффектов на последующие клеточные пути . PA и его липидные производные участвуют во множестве процессов, которые включают перемещение внутриклеточных пузырьков , эндоцитоз , экзоцитоз , динамику актинового цитоскелета , дифференцировку клеточной пролиферации и миграцию .

Рисунок 1. Модель ARF- зависимой активации фосфолипазы D и предлагаемая схема эндоцитоза везикул . В этой модели ARF активирует фосфолипазу D ( PLD ), рекрутируя ее на плазматическую мембрану . Гидролиз из фосфатидилхолина ( PC ) с помощью ARF-активированной PLD производит фосфатидную кислоту ( PA ). ПА затем набирает молекулы , которые формируют внутреннюю поверхность в липидный бислой , облегчая образование везикул . Локальное обогащение кислых фосфолипидов помогают вербовать адаптер белков ( AP ) и белки оболочки ( СР ) к мембране , инициирующие почкование в пузырьке . Деление везикул в конечном итоге опосредуется динамином , который сам является нижестоящим эффектором PA.

PLD млекопитающих напрямую взаимодействует с киназами, такими как PKC , ERK , TYK, и контролирует передачу сигналов, указывающую, что PLD активируется этими киназами. Поскольку холина очень много в клетке, активность PLD существенно не влияет на уровень холина, и холин вряд ли будет играть какую-либо роль в передаче сигналов.

Фосфатидная кислота является сигнальной молекулой и действует, рекрутируя SK1 на мембраны . PA чрезвычайно короткоживущий и быстро гидролизуется ферментом фосфатидатфосфатазой с образованием диацилглицерина (DAG). DAG также может быть преобразован в PA с помощью киназы DAG . Хотя PA и DAG взаимопревращаемы, они действуют по- разному . Стимулы , активирующие PLD, не активируют ферменты, расположенные ниже DAG, и наоборот.

Возможно, что, хотя PA и DAG являются взаимопревращаемыми, отдельные пулы сигнальных и несигнальных липидов могут сохраняться. Исследования показали, что передача сигналов DAG опосредуется полиненасыщенным DAG, в то время как PA, производный от PLD, является мононенасыщенным или насыщенным . Таким образом, функциональный насыщенный / мононенасыщенный PA может быть разложен путем его гидролиза с образованием нефункционального насыщенного / мононенасыщенного DAG, в то время как функциональный полиненасыщенный DAG может быть разложен путем преобразования его в нефункциональный полиненасыщенный PA.

Лизофосфолипаза D, называемая аутотаксином, недавно была идентифицирована как играющая важную роль в пролиферации клеток через свой продукт, лизофосфатидную кислоту (LPA).

Состав

PLD растений и животных имеют последовательную молекулярную структуру , характеризующуюся участками катализа, окруженными набором регуляторных последовательностей . Активный сайт из ПЛИС состоит из четырех высоко консервативных аминокислотных последовательностей (I-IV), из которых мотивов II и IV являются особенно сохраняются. Эти структурные домены содержат отличительную каталитическую последовательность HxKxxxxD (HKD), где H , K и D - это аминокислоты гистидин (H), лизин (K), аспарагиновая кислота (D), а x представляет собой неконсервативные аминокислоты . Эти два мотива HKD придают PLD гидролитическую активность и имеют решающее значение для его ферментативной активности как in vitro, так и in vivo . Гидролиз в фосфодиэфирной связи происходит тогда , когда эти HKD последовательности находятся в правильной близости .

Белки человека, содержащие этот мотив, включают:

• PGS1 , PLD1 , PLD2 , PLD3 , PLD4 , PLD5

ПК -hydrolyzing ПЛУ представляет собой гомолог из кардиолипина - синтазы , фосфатидилсерина - синтазы , бактериальных ПЛИС, и вирусные белки . Каждый из них, по-видимому, обладает дупликацией домена, о чем свидетельствует присутствие двух мотивов HKD, содержащих хорошо консервативные остатки гистидина , лизина и аспарагина, которые могут вносить вклад в активный центр аспарагиновой кислоты . Кишечной палочки эндонуклеазы (NUC) и подобные белки , как представляется, PLD гомологи , но обладают только один из этих мотивов.

Гены PLD дополнительно кодируют высококонсервативные регуляторные домены : консенсусную последовательность фосфора (PX) , домен гомологии плекстрина (PH) и сайт связывания для фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP ₂ ).

Механизм катализа

Было предложено, чтобы гидролиз, катализируемый PLD, происходил в две стадии по механизму « пинг-понга ». В этой схеме гистидиновых остатков каждого HKD мотива последовательно атаки на фосфолипидный субстрат . Функционирование в качестве нуклеофилов , Учредительного имидазол фрагменты этих гистидинов образуют переходные ковалентные связи с фосфолипидами , производя недолговечный промежуточным , которые могут быть легко гидролизуются водой в последующей стадии .

Презентация субстрата ; PLD (синий овал) изолируется в холестерин-зависимые липидные домены (зеленые липиды) путем пальмитоилирования . PLD также связывает домены PIP2 (красный шестиугольник) (серый цвет), расположенные в неупорядоченной области клетки, с фосфатидилхолином (PC). Когда PIP2 увеличивается в клетке, PLD перемещается в PIP2, где он подвергается действию и гидролизует PC до фосфатидной кислоты (красный сферический липид).

Механизм активации

Презентация субстрата. Для PLD2 млекопитающих молекулярной основой активации является презентация субстрата. Фермент находится в неактивном состоянии в липидных микродоменах, богатых сфингомиелином и обедненных субстратом ПК. Увеличение PIP2 или снижение холестерина заставляет фермент перемещаться в микродомены PIP2 рядом с его субстратом PC. Следовательно, PLD может в первую очередь активируется локализацией внутри плазматической мембраны, а не конформационным изменением белка. Нарушение липидных доменов анестетиками. или механическое усилие. Белок также может претерпевать конформационные изменения при связывании PIP2, но это не было показано экспериментально и могло бы составлять механизм активации, отличный от представления субстрата.

Изоформы

В клетках млекопитающих были идентифицированы две основные изоформы фосфолипазы D : PLD1 и PLD2 (53% гомологии последовательностей ), каждая из которых кодируется отдельными генами . Активность PLD, по-видимому, присутствует в большинстве типов клеток , за возможным исключением периферических лейкоцитов и других лимфоцитов . Обе изоформы PLD требуют PIP ₂ в качестве кофактора для активности . PLD1 и PLD2 обнаруживают разные субклеточные локализации, которые динамически изменяются в ходе передачи сигнала . Активность PLD наблюдалась в плазматической мембране , цитозоле , ER и комплексе Гольджи .

PLD1

PLD1 представляет собой белок массой 120 кДа, который в основном расположен на внутренних мембранах клеток. Он в основном присутствует в комплексе Гольджи , эндосомах , лизосомах и секреторных гранулах . По факту связывания из внеклеточного стимула, PLD1 будет транспортируются к плазматической мембране . Активность Базального PLD1 является низкой , однако, и для того , чтобы трансдукции внеклеточного сигнала, он сначала должен быть активирован с помощью белков , таких как Arf , Rho , Rac и протеинкиназы С .

Регулирование

Активность фосфолипазы D широко регулируется с помощью гормонов , нейротрансмиттеров , липидов , небольших мономерных ГТФаз и других небольших молекул , которые связываются с их соответствующими доменами на ферменте. В большинстве случаев передача сигнала опосредуется производством фосфатидной кислоты , которая функционирует как вторичный мессенджер .

Специфические фосфолипиды являются регуляторами активности PLD в клетках растений и животных. Большинству PLD требуется фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (PIP ₂ ) в качестве кофактора активности. PIP ₂ и другие фосфоинозитиды являются важными модификаторами динамики цитоскелета и мембранного транспорта и могут передавать PLD на его субстрат PC. PLD, регулируемые этими фосфолипидами , обычно участвуют во внутриклеточной передаче сигнала . Их активность зависит от связывания этих фосфоинозитидов вблизи активного центра . У растений и животных, этот сайт связывания характеризуются наличием консервативной последовательности из основных и ароматических аминокислот . У растений, таких как Arabidopsis thaliana , эта последовательность состоит из мотива RxxxxxKxR вместе с его инвертированным повтором , где R - аргинин, а K - лизин . Его близость к активному сайту обеспечивает высокий уровень активности PLD1 и PLD2 и способствует перемещению PLD1 к мембранам- мишеням в ответ на внеклеточные сигналы.

C2 домен

Кальций действует как кофактор в изоформах PLD , содержащих домен C2 . Связывание Ca ²⁺ с доменом C2 приводит к конформационным изменениям в ферменте, которые усиливают связывание фермент-субстрат , в то же время ослабляя связь с фосфоинозитидами . В некоторых растительных изоферментах , таких как PLDβ , Ca ²⁺ может связываться непосредственно с активным сайтом , косвенно увеличивая его сродство к субстрату за счет усиления связывания активатора PIP ₂ .

PX домен

Последовательность PBOX консенсуса (ПВ) , как полагает, опосредовать связывание дополнительных фосфатидилинозитол фосфатов, в частности, фосфатидилинозитолы 5-фосфат (PtdIns5P), липид Полагает , что требуется для эндоцитоза , может помочь облегчить reinternalization из PLD1 из плазматической мембраны .

Домен PH

Высококонсервативный домен гомологии плэкстрина (PH) представляет собой структурный домен длиной примерно 120 аминокислот . Он связывает фосфатидилинозитиды, такие как фосфатидилинозитол (3,4,5) -трисфосфат (PIP ₃ ) и фосфатидилинозитол (4,5) -бисфосфат (PIP ₂ ). Он также может связывать гетеротримерные G-белки через их βγ-субъединицу . Также считается, что связывание с этим доменом способствует повторной интернализации белка за счет увеличения его сродства к эндоцитотическим липидным рафтам .

Взаимодействие с малыми GTPases

В клетках животных малые белковые факторы являются важными дополнительными регуляторами активности PLD. Этот небольшой мономерный GTPases являются членами этих Rho и ARF семей Рас надсемейства . Некоторые из этих белков, такие как Rac1 , Cdc42 и RhoA , аллостерически активируют PLD1 млекопитающих , напрямую увеличивая его активность. В частности, транслокации из цитозольного фактора АДФА-рибозилирования (РФ) к плазматической мембране имеют важное значение для активации PLD.

Физиологические и патофизиологические роли

Алкогольное опьянение

Фосфолипаза D метаболизирует этанол в фосфатидилэтанол (PEtOH) в процессе, называемом трансфосфатидилированием. Используя генетику мух, было показано, что PEtOH опосредует гиперактивную реакцию на алкоголь у плодовых мушек. И было показано, что трансфосфатидилирование этанола активируется у алкоголиков и членов их семей. Этот механизм трансфосфатидилирования этанола недавно появился в качестве альтернативной теории влияния алкоголя на ионные каналы. Многие ионные каналы регулируются анионными липидами. и конкуренция PEtOH с эндогенными сигнальными липидами, как полагают, в некоторых случаях опосредует действие этанола на ионные каналы, а не прямое связывание свободного этанола с каналом.

Механочувствительность

PLD2 является механосенсором и непосредственно чувствителен к механическому разрушению кластерных липидов GM1. Затем механическое разрушение (сдвиг жидкости) дает клетке сигнал к дифференцировке. PLD2 также активирует каналы TREK-1, калиевый канал в анальгетическом пути.

При раке

Фосфолипаза D является регулятором нескольких критических клеточных процессов, включая транспорт везикул , эндоцитоз , экзоцитоз , миграцию клеток и митоз . Нарушение регуляции этих процессов является обычным явлением в канцерогенезе , и, в свою очередь, нарушения экспрессии PLD участвуют в прогрессировании нескольких типов рака . Мутации водителя придание повышенной активности PLD2 наблюдается в ряде злокачественных опухолей молочной железы . Повышенная экспрессия PLD также коррелировала с размером опухоли при колоректальной карциноме , карциноме желудка и раке почек . Однако молекулярные пути, посредством которых PLD способствует прогрессированию рака, остаются неясными. Одна из возможных гипотез предполагает, что фосфолипаза D играет важную роль в активации mTOR , супрессора апоптоза раковых клеток . Способность PLD подавлять апоптоз в клетках с повышенной активностью тирозинкиназы делает его кандидатом в онкоген при раке, где такая экспрессия является типичной.

При нейродегенеративных заболеваниях

Фосфолипазы D может также играть важную патофизиологический роль в прогрессии от нейродегенеративных заболеваний , прежде всего за счет его способности в качестве преобразователя сигнала в необходимых клеточных процессах , таких как цитоскелета реорганизации и торговли везикул . Было показано, что нарушение регуляции PLD с помощью белка α-синуклеина приводит к специфической потере дофаминергических нейронов у млекопитающих . α-синуклеин является основным структурным компонентом телец Леви , белковых агрегатов, которые являются признаком болезни Паркинсона . Ингибирование PLD α-синуклеином может вносить вклад в вредный фенотип Паркинсона .

Аномальные PLD активность также подозревается в болезни Альцгеймера , где наблюдаются взаимодействие с пресенилином 1 (PS-1), основной компонент γ-секретазами комплекс отвечает за ферментативное расщепление из белка - предшественника амилоида (APP). Внеклеточные бляшки из продукта бета-амилоида является определяющей чертой от больных с болезнью Альцгеймера мозг. Действие PLD1 на PS-1 было показано , что влияет на внутриклеточный оборот в предшественнике амилоида в этот комплекс . Фосфолипаза D3 (PLD3), неклассический и плохо охарактеризованный член суперсемейства PLD , также была связана с патогенезом этого заболевания.

Галерея

• 

  Фосфатидилхолин

• 

  Фосфатидат

• 

  Холин

• 

  Сайты расщепления фосфолипазой

использованная литература

внешние ссылки

• Фосфолипаза + D в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)