Плазмида - Plasmid

Иллюстрация бактерии с хромосомной ДНК и плазмидами (не в масштабе)

Плазмиду представляет собой небольшой, внехромосомной ДНК - молекулы в клетке, которая физически отделена от хромосомной ДНК и могут реплицироваться независимо друг от друга. Чаще всего они встречаются в бактериях в виде небольших кольцевых двухцепочечных молекул ДНК ; однако плазмиды иногда присутствуют у архей и эукариотических организмов . В природе плазмиды часто несут гены, которые способствуют выживанию организма и придают селективное преимущество, такое как устойчивость к антибиотикам.. Хотя хромосомы большие и содержат всю важную генетическую информацию для жизни в нормальных условиях, плазмиды обычно очень маленькие и содержат только дополнительные гены, которые могут быть полезны в определенных ситуациях или условиях. Искусственные плазмиды широко используются в качестве векторов в молекулярном клонировании , служа для управления репликацией последовательностей рекомбинантной ДНК в организмах-хозяевах. В лаборатории плазмиды могут быть введены в клетку путем трансформации . Синтетические плазмиды доступны для приобретения через Интернет.

Плазмиды считаются репликонами , единицами ДНК, способными автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Однако плазмиды, как и вирусы , обычно не классифицируются как живые . Плазмиды передаются от одной бактерии к другой (даже от другого вида) в основном путем конъюгации . Этот перенос генетического материала от хозяина к хозяину является одним из механизмов горизонтального переноса генов , а плазмиды считаются частью мобилома . В отличие от вирусов, которые заключают свой генетический материал в защитную белковую оболочку, называемую капсидом , плазмиды представляют собой «голую» ДНК и не кодируют гены, необходимые для того, чтобы заключить генетический материал в оболочку для передачи новому хозяину; однако некоторые классы плазмид кодируют конъюгативный «половой» пилус, необходимый для их собственного переноса. Размер плазмиды варьируется от 1 до более 200 тыс. Пар оснований , а количество идентичных плазмид в одной клетке может варьироваться от одной до тысячи при некоторых обстоятельствах.

История

Термин плазмида был введен в 1952 году американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом для обозначения «любой внехромосомной наследственной детерминанты». Раннее использование этого термина включало любой бактериальный генетический материал, который существует вне хромосом, по крайней мере, в течение части его цикла репликации, но поскольку это описание включает бактериальные вирусы, понятие плазмиды было уточнено с течением времени, чтобы включать генетические элементы, которые воспроизводятся автономно. Позже, в 1968 году, было решено, что термин плазмида следует использовать как термин для внехромосомного генетического элемента, и чтобы отличить его от вирусов, определение было сужено до генетических элементов, которые существуют исключительно или преимущественно вне хромосомы и могут воспроизводиться автономно.

Свойства и характеристики

Существует два типа интеграции плазмид в бактерии-хозяева: неинтегрирующиеся плазмиды реплицируются, как в верхнем экземпляре, тогда как эписомы , нижний пример, могут интегрироваться в хромосому хозяина .

Для того чтобы плазмиды могли независимо реплицироваться в клетке, они должны обладать участком ДНК, который может действовать как точка начала репликации . Самовоспроизводящаяся единица, в данном случае плазмида, называется репликоном . Типичный бактериальный репликон может состоять из ряда элементов, таких как ген плазмид-специфичного белка инициации репликации (Rep), повторяющиеся единицы, называемые итеронами , DnaA- боксы и прилегающая область, богатая AT. Плазмиды меньшего размера используют репликативные ферменты хозяина для создания собственных копий, в то время как плазмиды большего размера могут нести гены, специфичные для репликации этих плазмид. Некоторые типы плазмид также могут вставляться в хромосому хозяина, и эти интегративные плазмиды иногда называют эписомами у прокариот.

Плазмиды почти всегда несут хотя бы один ген. Многие из генов, содержащихся в плазмиде, полезны для клеток-хозяев, например: позволяют клетке-хозяину выживать в среде, которая в противном случае была бы летальной или ограничивала бы рост. Некоторые из этих генов кодируют признаки устойчивости к антибиотикам или устойчивости к тяжелым металлам, в то время как другие могут продуцировать факторы вирулентности, которые позволяют бактерии колонизировать хозяина и преодолевать его защиту, или обладают определенными метаболическими функциями, которые позволяют бактерии использовать определенное питательное вещество, включая способность разлагать стойкие или токсичные органические соединения. Плазмиды также могут обеспечивать бактерии способность связывать азот . Однако некоторые плазмиды не оказывают заметного влияния на фенотип клетки-хозяина или невозможно определить их пользу для клеток-хозяев, и эти плазмиды называются криптическими плазмидами.

Природные плазмиды сильно различаются по своим физическим свойствам. Их размер может варьироваться от очень маленьких мини-плазмид с парой менее 1 килобаз (Kbp) до очень больших мегаплазмид с несколькими парами мегабаз (Mbp). На верхнем конце мегаплазмида и минихромосома мало чем отличаются . Плазмиды обычно имеют круглую форму, но известны также примеры линейных плазмид. Эти линейные плазмиды требуют специальных механизмов для репликации их концов.

Плазмиды могут присутствовать в отдельной клетке в разном количестве, от одной до нескольких сотен. Нормальное число копий плазмиды , которые могут быть найдены в одной ячейке, называют плазмиду числа копий , и определяется , как регулируются инициация репликации и размера молекулы. Плазмиды большего размера, как правило, имеют меньшее количество копий. Плазмиды с низким числом копий, которые существуют только в виде одной или нескольких копий в каждой бактерии, после деления клетки подвергаются опасности быть потерянными в одной из разделяющих бактерий. Такие однокопийные плазмиды имеют системы, которые пытаются активно распространять копию по обеим дочерним клеткам. Эти системы, которые включают в себя систему parABS и систему parMRC , часто упоминаются как системы раздела или функцию разбиения плазмиды.

Классификации и виды

Обзор бактериальной конъюгации
Электронная микрофотография пучка волокон ДНК, предположительно одной петли бактериальной хромосомы
Электронная микрофотография плазмиды бактериальной ДНК (фрагмент хромосомы)

Плазмиды можно классифицировать по-разному. Плазмиды можно в целом разделить на конъюгативные плазмиды и неконъюгативные плазмиды. Конъюгативные плазмиды содержат набор генов-переносчиков, которые способствуют половой конъюгации между различными клетками. В сложном процессе конъюгации плазмиды могут передаваться от одной бактерии к другой через половые пили, кодируемые некоторыми генами-переносчиками (см. Рисунок). Неконъюгативные плазмиды не способны инициировать конъюгацию, поэтому их можно переносить только с помощью конъюгативных плазмид. Промежуточный класс плазмид является подвижным и несет только подмножество генов, необходимых для переноса. Они могут паразитировать на конъюгированной плазмиде, передаваясь с высокой частотой только в ее присутствии.

Плазмиды также можно разделить на группы несовместимости. Микроб может содержать разные типы плазмид, но разные плазмиды могут существовать только в одной бактериальной клетке, если они совместимы. Если две плазмиды несовместимы, одна или другая будет быстро потеряна из клетки. Следовательно, разные плазмиды могут быть отнесены к разным группам несовместимости в зависимости от того, могут ли они сосуществовать вместе. Несовместимые плазмиды (принадлежащие к одной группе несовместимости) обычно используют одни и те же механизмы репликации или разделения и, таким образом, не могут храниться вместе в одной клетке.

Другой способ классификации плазмид - по функциям. Есть пять основных классов:

Плазмиды могут принадлежать более чем к одной из этих функциональных групп.

РНК плазмиды

Хотя большинство плазмид представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК, некоторые из них состоят из одноцепочечной ДНК или преимущественно двухцепочечной РНК. РНК-плазмиды представляют собой неинфекционные внехромосомные линейные репликоны РНК, как инкапсидированные, так и неинкапсидированные, которые были обнаружены в грибах и различных растениях, от водорослей до наземных растений. Однако во многих случаях может быть трудно или невозможно четко отличить РНК-плазмиды от РНК-вирусов и других инфекционных РНК.

Векторы

Искусственно сконструированные плазмиды могут использоваться в качестве векторов в генной инженерии . Эти плазмиды служат важными инструментами в лабораториях генетики и биотехнологии, где они обычно используются для клонирования и амплификации (создания множества копий) или экспрессии определенных генов. Для такого использования коммерчески доступно большое количество плазмид. Реплицируемый ген обычно вставляют в плазмиду, которая обычно содержит ряд функций для их использования. К ним относятся ген, который придает устойчивость к определенным антибиотикам ( ампициллин наиболее часто используется для бактериальных штаммов), точку начала репликации, позволяющую бактериальным клеткам реплицировать плазмидную ДНК, и подходящий сайт для клонирования (называемый сайтом множественного клонирования. ).

Структурную нестабильность ДНК можно определить как серию спонтанных событий, которые завершаются непредвиденной перестройкой, потерей или приобретением генетического материала. Такие события часто инициируются перемещением мобильных элементов или наличием нестабильных элементов, таких как неканонические (не B) структуры. Дополнительные области, относящиеся к бактериальному остову, могут участвовать в широком диапазоне явлений структурной нестабильности. Хорошо известные катализаторы генетической нестабильности включают прямые, инвертированные и тандемные повторы, которые, как известно, заметны в большом количестве коммерчески доступных векторов клонирования и экспрессии. Последовательности вставки также могут серьезно влиять на функцию и выход плазмиды, приводя к делециям и перестройкам, активации, подавлению или инактивации экспрессии соседних генов. Следовательно, уменьшение или полное устранение посторонних некодирующих последовательностей основной цепи значительно снизило бы склонность к возникновению таких событий и, следовательно, общий рекомбиногенный потенциал плазмиды.

Схематическое изображение плазмиды pBR322 , одной из первых плазмид, широко используемых в качестве вектора клонирования . На диаграмме плазмиды показаны кодируемые гены ( amp и tet для устойчивости к ампициллину и тетрациклину соответственно), его начало репликации ( ori ) и различные сайты рестрикции (обозначены синим).

Клонирование

Плазмиды являются наиболее часто используемыми векторами для клонирования бактерий. Эти клонирующие векторы содержат сайт, который позволяет вставлять фрагменты ДНК, например сайт множественного клонирования или полилинкер, который имеет несколько обычно используемых сайтов рестрикции, с которыми можно лигировать фрагменты ДНК . После вставки интересующего гена плазмиды вводятся в бактерии с помощью процесса, называемого трансформацией . Эти плазмиды содержат селективный маркер , обычно ген устойчивости к антибиотикам, который придает бактериям способность выживать и размножаться в селективной среде для роста, содержащей определенные антибиотики. Клетки после трансформации подвергаются воздействию селективной среды, и выживают только клетки, содержащие плазмиду. Таким образом, антибиотики действуют как фильтр, отбирающий только бактерии, содержащие плазмидную ДНК. Вектор также может содержать другие маркерные гены или репортерные гены для облегчения отбора плазмид с клонированными вставками. Бактерии, содержащие плазмиду, затем можно выращивать в больших количествах, собирать и затем выделять представляющую интерес плазмиду с использованием различных способов получения плазмиды .

Вектор плазмиды клонирования , как правило , используются для фрагментов клона ДНК размера до 15 кб . Для клонирования ДНК большей длины используются лямбда-фаг с удаленными генами лизогении, космиды , бактериальные искусственные хромосомы или искусственные хромосомы дрожжей .

Производство белка

Еще одно важное применение плазмид - производство большого количества белков. В этом случае исследователи выращивают бактерии, содержащие плазмиду, несущую интересующий ген. Так же, как бактерия вырабатывает белки, придающие ей устойчивость к антибиотикам, ее также можно заставить производить большое количество белков из встроенного гена. Это дешевый и простой способ массового производства белка, кодируемого геном, например, инсулина .

Генная терапия

Плазмиды также можно использовать для переноса генов в качестве потенциального лечения в генной терапии, чтобы они могли экспрессировать белок, которого не хватает в клетках. Некоторые формы генной терапии требуют встраивания терапевтических генов в предварительно выбранные хромосомные участки-мишени в геноме человека . Плазмидные векторы - один из многих подходов, которые можно использовать для этой цели. Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) предлагают способ вызвать сайт-специфический двухцепочечный разрыв генома ДНК и вызвать гомологичную рекомбинацию . Плазмиды, кодирующие ZFN, могут помочь доставить терапевтический ген в определенное место, чтобы избежать повреждения клеток, мутаций, вызывающих рак, или иммунного ответа.

Модели заболеваний

Плазмиды исторически использовались для генетической инженерии эмбриональных стволовых клеток крыс для создания моделей генетических заболеваний крыс. Ограниченная эффективность методов на основе плазмид не позволила их использовать для создания более точных моделей клеток человека. Однако развитие методов рекомбинации аденоассоциированных вирусов и нуклеаз «цинковые пальцы» позволило создать новое поколение моделей изогенных заболеваний человека .

Эписомы

Термин эписома был введен Франсуа Жакобом и Эли Уоллманом в 1958 году для обозначения внехромосомного генетического материала, который может реплицироваться автономно или интегрироваться в хромосому. Однако с тех пор, как этот термин был введен, его использование изменилось, поскольку плазмида стала предпочтительным термином для автономной репликации внехромосомной ДНК. На симпозиуме 1968 года в Лондоне некоторые участники предложили отказаться от термина « эписома» , хотя другие продолжали использовать этот термин с изменением значения.

Сегодня некоторые авторы используют эписому в контексте прокариот для обозначения плазмиды, способной интегрироваться в хромосому. Интегративные плазмиды могут реплицироваться и стабильно сохраняться в клетке в течение нескольких поколений, но на некотором этапе они будут существовать как независимая плазмидная молекула. В контексте эукариот термин эписома используется для обозначения неинтегрированной внехромосомной замкнутой кольцевой молекулы ДНК, которая может реплицироваться в ядре. Наиболее распространенными примерами этого являются вирусы, такие как герпесвирусы , аденовирусы и полиомавирусы , но некоторые из них являются плазмидами. Другие примеры включают аберрантные хромосомные фрагменты, такие как двухминутные хромосомы , которые могут возникать во время искусственных амплификаций генов или при патологических процессах (например, трансформации раковых клеток). Эписомы у эукариот ведут себя аналогично плазмидам прокариот в том, что ДНК стабильно сохраняется и реплицируется с клеткой-хозяином. Также могут возникать цитоплазматические вирусные эписомы (как при поксвирусных инфекциях). Некоторые эписомы, такие как вирусы герпеса, реплицируются по механизму катящегося круга , подобно бактериофагам (вирусам бактериальных фагов). Другие реплицируются посредством механизма двунаправленной репликации ( плазмиды тета-типа ). В любом случае эписомы остаются физически отделенными от хромосом клетки-хозяина. Некоторые раковые вирусы, в том числе вирус Эпштейна-Барра и герпесвирус, связанный с саркомой Капоши , сохраняются в виде латентных, отдельных по хромосоме эписом в раковых клетках, где вирусы экспрессируют онкогены , способствующие пролиферации раковых клеток. При раке эти эписомы пассивно реплицируются вместе с хромосомами хозяина при делении клетки. Когда эти вирусные эписомы инициируют литическую репликацию с образованием множества вирусных частиц, они обычно активируют защитные механизмы клеточного врожденного иммунитета, которые убивают клетку-хозяина.

Поддержание плазмид

Некоторые плазмиды или микробные хозяева включают систему зависимости или постсегрегационную систему уничтожения (PSK), такую ​​как система hok / sok (уничтожение хозяина / супрессор уничтожения) плазмиды R1 в Escherichia coli . Этот вариант производит как долгоживущий яд, так и недолговечное противоядие . Несколько типов систем плазмидной зависимости (токсин / антитоксин, системы на основе метаболизма, системы ORT) были описаны в литературе и использовались в биотехнических (ферментация) или биомедицинских (вакцинационная терапия) приложениях. Дочерние клетки, которые сохраняют копию плазмиды, выживают, в то время как дочерняя клетка, которая не может наследовать плазмиду, умирает или страдает сниженной скоростью роста из-за оставшегося яда от родительской клетки. Наконец, можно повысить общую производительность.

Напротив, плазмиды, используемые в биотехнологии, такие как pUC18, pBR322 и производные векторы, вряд ли когда-либо содержат системы токсин-антитоксиновой зависимости, и поэтому их необходимо держать под давлением антибиотиков, чтобы избежать потери плазмиды.

Плазмиды дрожжей

В природе дрожжи содержат различные плазмиды. Среди них выделяются плазмиды размером 2 мкм - маленькие кольцевые плазмиды, часто используемые для генной инженерии дрожжей, - и линейные плазмиды pGKL из Kluyveromyces lactis , которые ответственны за фенотипы-киллеры .

Другие типы плазмид часто связаны с векторами клонирования дрожжей, которые включают:

  • Интегративная плазмида дрожжей (YIp) , дрожжевые векторы, которые зависят от интеграции в хромосому хозяина для выживания и репликации и обычно используются при изучении функциональности соло-гена или когда ген токсичен. Также связан с геном URA3, который кодирует фермент, связанный с биосинтезом пиримидиновых нуклеотидов (T, C);
  • Репликативная плазмида дрожжей (YRp) , которая транспортирует последовательность хромосомной ДНК, которая включает точку начала репликации. Эти плазмиды менее стабильны, так как они могут быть потеряны во время бутонизации.

Экстракция плазмидной ДНК

Плазмиды часто используются для очистки определенной последовательности, поскольку их можно легко очистить от остальной части генома. Для использования в качестве векторов и для молекулярного клонирования плазмиды часто необходимо изолировать.

Существует несколько методов выделения плазмидной ДНК из бактерий, от минипрепа до максипрепа или массового препарирования . Первый можно использовать для быстрого определения правильности плазмиды в каком-либо из нескольких бактериальных клонов. Выход представляет собой небольшое количество нечистой плазмидной ДНК, которого достаточно для анализа рестрикционным гидролизом и для некоторых методов клонирования.

В последнем выращиваются гораздо большие объемы бактериальной суспензии, из которых можно проводить макси-препарирование. По сути, это увеличенный минипрепарат с последующей дополнительной очисткой. Это приводит к относительно большим количествам (несколько сотен микрограммов) очень чистой плазмидной ДНК.

Было создано множество коммерческих наборов для выполнения экстракции плазмид в различных масштабах, чистоте и уровнях автоматизации.

Конформации

Плазмидная ДНК может находиться в одной из пяти конформаций, которые (для данного размера) перемещаются с разной скоростью в геле во время электрофореза . Конформации перечислены ниже в порядке электрофоретической подвижности (скорости для данного приложенного напряжения) от самой медленной до самой быстрой:

  • Разрезанная кольцевая ДНК с разомкнутой цепью имеет разрез по одной нити.
  • Расслабленная кольцевая ДНК полностью неповреждена, обе нити не разрезаны, но ферментативно расслаблена (суперспирали удалены). Это можно смоделировать, позволив скрученному удлинителю размотаться и расслабиться, а затем подключить его к самому себе.
  • Линейная ДНК имеет свободные концы либо потому, что обе нити были разрезаны, либо потому, что ДНК была линейной in vivo . Это можно смоделировать с помощью электрического удлинителя, который не вставлен сам в себя.
  • Суперспиральная (или ковалентно замкнутая круглая ) ДНК полностью неповреждена, обе нити не разрезаны, и с цельным скручением, что приводит к компактной форме. Это можно смоделировать, скручивая удлинитель, а затем вставляя его в себя.
  • Суперспиральная денатурированная ДНК похожа на суперспиральную ДНК , но имеет непарные участки, которые делают ее немного менее компактной; это может быть результатом чрезмерной щелочности во время приготовления плазмиды.

Скорость миграции небольших линейных фрагментов прямо пропорциональна приложенному напряжению при низких напряжениях. При более высоких напряжениях более крупные фрагменты перемещаются с постоянно увеличивающейся, но разной скоростью. Таким образом, разрешение геля уменьшается с увеличением напряжения.

При заданном низком напряжении скорость миграции небольших линейных фрагментов ДНК является функцией их длины. Большие линейные фрагменты (более 20 кб или около того) перемещаются с определенной фиксированной скоростью независимо от длины. Это происходит потому, что молекулы «дышат», при этом основная часть молекулы следует за передним концом через гелевую матрицу. Рестрикционные переваривания часто используются для анализа очищенных плазмид. Эти ферменты специально разрушают ДНК в определенных коротких последовательностях. Полученные линейные фрагменты образуют «полосы» после гель-электрофореза . Некоторые фрагменты можно очистить, вырезав полосы из геля и растворив гель для высвобождения фрагментов ДНК.

Из-за своей плотной конформации суперспиральная ДНК мигрирует через гель быстрее, чем линейная или открытая кольцевая ДНК.

Программное обеспечение для биоинформатики и дизайна

Использование плазмид в качестве метода молекулярной биологии поддерживается программным обеспечением для биоинформатики . Эти программы записывают последовательность ДНК плазмидных векторов, помогают прогнозировать участки разреза рестрикционных ферментов и планировать манипуляции. Примерами пакетов программного обеспечения, которые обрабатывают карты плазмид, являются ApE, Clone Manager , GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler , LabGenius, Lasergene, MacVector , pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI и WebDSV. Эти части программного обеспечения помогают проводить полные эксперименты in silico перед проведением влажных экспериментов.

Коллекции плазмид

За прошедшие годы было создано множество плазмид, и исследователи передали плазмиды в базы данных плазмид, такие как некоммерческие организации Addgene и BCCM / LMBP . В этих базах данных можно найти и запросить плазмиды для исследования. Исследователи также часто загружают последовательности плазмид в базу данных NCBI , из которой можно извлечь последовательности конкретных плазмид.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

Общие работы

  • Кляйн Д.В., Прескотт Л.М., Харлей Дж. (1999). Микробиология . Бостон: WCB / McGraw-Hill.
  • Моат А.Г., Фостер Дж. В., Спектор депутат (2002). Микробная физиология . Wiley-Liss. ISBN 978-0-471-39483-9.
  • Смит CU (2002). «Глава 5: Манипулирование биомолекулами» . Элементы молекулярной нейробиологии (3-е изд.). Чичестер, Западный Сассекс, Англия: Wiley. С. 101–11. ISBN 978-0-470-85717-5.

Эписомы

внешние ссылки