Гель-электрофорез в импульсном поле - Pulsed-field gel electrophoresis

Микробиолог проводит тест на гель-электрофорез в импульсном поле, используемый для бактериального типирования.

Гель-электрофорез в импульсном поле - это метод, используемый для разделения больших молекул ДНК путем приложения к гелевой матрице электрического поля, которое периодически меняет направление.

Историческое прошлое

Стандартные методы гель-электрофореза для разделения молекул ДНК предоставили огромные преимущества для исследований в области молекулярной биологии. Однако он не смог эффективно разделить очень большие молекулы ДНК. Молекулы ДНК размером более 15-20 т.п.н., мигрирующие через гель, будут перемещаться вместе независимо от размера. В 1984 г. в Колумбийском университете Дэвид С. Шварц и Чарльз Кантор разработали вариант стандартного протокола, введя переменный градиент напряжения для улучшения разрешения более крупных молекул. Этот метод стал известен как гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE). Разработка PFGE расширила диапазон разрешения для фрагментов ДНК на два порядка.

Процедура

Кластерный анализ в BioNumerics энтероагрегативных штаммов Escherichia coli с помощью снятия отпечатков пальцев с гель-электрофорезом в импульсном поле

Процедура этого метода относительно аналогична выполнению стандартного гель-электрофореза, за исключением того, что вместо того, чтобы постоянно пропускать напряжение в одном направлении, напряжение периодически переключается между тремя направлениями; одна проходит через центральную ось геля, а две - под углом 60 градусов с каждой стороны. Время импульсов одинаково для каждого направления, что приводит к чистой прямой миграции ДНК. Для очень больших молекул (примерно до 2 Мбит / с) можно использовать линейные изменения интервала переключения, которые увеличивают время импульса для каждого направления в течение нескольких часов - например, линейное увеличение импульса с 10 секунд при 0 часов до 60 секунд в 18 часов.

Эта процедура занимает больше времени, чем обычный гель-электрофорез из-за размера разделяемых фрагментов и того факта, что ДНК не движется по прямой линии через гель.

Теория

Хотя в целом небольшие фрагменты могут проходить через гелевый матрикс легче, чем большие фрагменты ДНК, существует пороговая длина более 30–50 т.п.н., когда все большие фрагменты будут проходить с одинаковой скоростью и проявляться в геле в виде одного большого диффузного группа.

Однако при периодическом изменении направления поля ДНК различной длины реагируют на изменение с разной скоростью. То есть более крупные фрагменты ДНК будут медленнее перестраивать свой заряд при изменении направления поля, тогда как более мелкие фрагменты будут быстрее. С течением времени при последовательном изменении направлений каждая полоса начнет отделяться все больше и больше даже на очень больших участках. Таким образом, становится возможным разделение очень больших фрагментов ДНК с помощью PFGE.

Приложения

PFGE можно использовать для генотипирования или генетического снятия отпечатков пальцев . В течение нескольких десятилетий он обычно считался золотым стандартом в эпидемиологических исследованиях патогенных организмов. Например, определение подтипов бактериальных изолятов с помощью этого метода упростило различение штаммов Listeria monocytogenes и, таким образом, установление связи между экологическими или пищевыми изолятами с клиническими инфекциями. В настоящее время он заменяется методами секвенирования нового поколения.

Смотрите также

Рекомендации

внешняя ссылка