c-Raf - c-Raf

RAF1
Белок RAF1 PDB 1c1y.png
Доступные конструкции
PDB Ортолог поиск: PDBe RCSB
Идентификаторы
Псевдонимы RAF1 , протоонкоген Raf-1, серин / треонин киназа, CMD1NN, CRAF, NS5, Raf-1, c-Raf
Внешние идентификаторы OMIM : 164760 MGI : 97847 HomoloGene : 48145 GeneCards : RAF1
Ортологи
Разновидность Человек Мышь
Entrez
Ансамбль
UniProt
RefSeq (мРНК)

NM_002880

NM_029780
NM_001356333
NM_001356334

RefSeq (белок)

NP_084056
NP_001343262
NP_001343263

Расположение (UCSC) н / д Chr 6: 115.62 - 115.68 Мб
PubMed поиск
Викиданные
Просмотр / редактирование человека Просмотр / редактирование мыши

РФС протоонкоген серин / треонин-протеинкиназа, также известная как прото-онкоген с-RAF или просто с-Raf или даже Raf-1, представляет собой фермент , который у человека кодируется с помощью RAF1 гена . Белок c-Raf является частью пути ERK1 / 2 как MAP-киназа (MAP3K), которая функционирует ниже подсемейства Ras мембраносвязанных GTPases. С-Raf является членом Raf киназы семейства серин / треонин специфических протеинкиназ , от TKL (тирозин-киназа-подобный) группы киназ.

Открытие

Первый ген Raf, v-Raf, был обнаружен в 1983 году. Он был выделен из мышиного ретровируса с номером 3611. Вскоре было продемонстрировано, что он способен преобразовывать фибробласты грызунов в линии раковых клеток , поэтому этому гену было присвоено название Virus- индуцированная быстроускоренная фибросаркома (V-RAF). Год спустя в ретровирусе птиц MH2 был обнаружен другой трансформирующий ген, названный v-Mil, который оказался очень похожим на v-Raf. Исследователи смогли продемонстрировать, что эти гены кодируют ферменты, обладающие серин-треонинкиназной активностью. Нормальные клеточные гомологи v-Raf и v-Mil вскоре были обнаружены как в геноме мыши, так и в геноме курицы (отсюда и название c-Raf для нормального клеточного гена Raf), и стало ясно, что они тоже играют роль в регулировании роста и деление клеток. Теперь мы знаем, что c-Raf является основным компонентом первого описанного пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK): передачи сигналов ERK1 / 2 . Он действует как киназа MAP3, инициируя весь каскад киназ. Последующие эксперименты показали, что нормальные клеточные гены Raf также могут мутировать, чтобы стать онкогенами, «перегружая» активность MEK1 / 2 и ERK1 / 2. Фактически, геномы позвоночных содержат несколько генов Raf. Спустя несколько лет после открытия c-Raf были описаны еще две родственные киназы: A-Raf и B-Raf . Последнее стало предметом исследований в последние годы, поскольку большая часть опухолей человека несут онкогенные «драйверные» мутации в гене B-Raf. Эти мутации вызывают неконтролируемую высокую активность ферментов Raf. Таким образом, диагностический и терапевтический интерес к киназам Raf в последние годы достиг нового пика.

Состав

Ген c-Raf человека расположен на хромосоме 3 . Были описаны по крайней мере две изоформы мРНК (возникающие в результате включения или удаления альтернативного экзона ), которые обнаруживают лишь незначительные различия. Более короткая основная изоформа, состоящая из 17 экзонов, кодирует протеинкиназу из 648 аминокислот.

Схематическая архитектура человеческого белка c-Raf

Подобно многим другим MAPKKK , c-Raf является многодоменным белком с несколькими дополнительными доменами, которые помогают регулировать его каталитическую активность. На его N-концевом сегменте Ras-связывающий домен (RBD) и гомологичный домен 1 C-киназы (домен C1) находятся рядом друг с другом. Структуры обоих консервативных доменов были решены в последние десятилетия, что пролило свет на механизмы их регуляции.

В Рас-связывающий домен выводит на экран убиквитин-подобный раз (как и многие другие небольшие G-белка , связывающих доменов) и селективно связывается только ГТФ-связанные белки Ras. (Вы можете подробно рассмотреть это взаимодействие в блоке PDB, прикрепленном к статье. Он показывает Rap1 в комплексе с RBD c-Raf.)

Домена С1 - непосредственно ниже по потоку от Ras - связывающий домен - это специальный цинковый палец , богатый цистеинов и стабилизировали двумя ионами цинка. Он похож на диацилглицерин-связывающие С1-домены ферментов протеинкиназы С (PKC). Но в отличие от PKC, C1-домены киназ семейства Raf не связывают диацилглицерин. Вместо этого они взаимодействуют с другими липидами, такими как церамид или фосфатидная кислота, и даже способствуют распознаванию активированного Ras (GTP-Ras).

Непосредственная близость этих двух доменов, а также несколько линий экспериментальных данных позволяют предположить, что они действуют как единое целое, негативно регулируя активность домена протеинкиназы путем прямого физического взаимодействия. Исторически этот аутоингибиторный блок был обозначен как область CR1 («Консервированная область 1»), шарнирная область была названа CR2, а домен киназы CR3. К сожалению, точная структура аутоингибированной киназы остается неизвестной.

Между блоком аутоингибиторного домена и каталитическим доменом киназы можно найти длинный сегмент, характерный для всех белков Raf. Он сильно обогащен сериновыми аминокислотами, но его точная последовательность плохо сохраняется в родственных генах Raf. Эта область кажется изначально неструктурированной и очень гибкой. Его наиболее вероятная роль заключается в том, чтобы действовать как естественный «шарнир» между жестко свернутыми аутоингибиторным и каталитическим доменами, обеспечивая сложные движения и глубокие конформационные перестройки внутри молекулы. Эта шарнирная область содержит небольшой консервативный островок аминокислот, который отвечает за распознавание 14-3-3 белка , но только тогда, когда критический серин (Ser259 в человеческом c-Raf) фосфорилируется. Второй подобный мотив обнаружен на крайнем С-конце (с центром вокруг фосфорилируемого Ser 621) всех ферментов Raf, но ниже киназного домена.

С-концевая половина c-Raf складывается в единый белковый домен, ответственный за каталитическую активность. Структура этого киназного домена хорошо известна как для c-Raf, так и для B-Raf. Он очень похож на другие киназы Raf и белки KSR и отчетливо похож на некоторые другие киназы MAP3, такие как семейство киназ смешанного происхождения (MLK). Вместе они составляют группу протеинкиназ, подобную тирозинкиназе (TKL). Хотя некоторые особенности объединяют их каталитические домены с протеинтирозинкиназами, активность TKL ограничена фосфорилированием остатков серина и треонина внутри белков-мишеней. Самым важным субстратом киназ Raf (помимо себя) являются киназы MKK1 и MKK2 , активность которых строго зависит от событий фосфорилирования, выполняемых Rafs.

Эволюционные отношения

Человеческий c-Raf является членом более крупного семейства родственных протеинкиназ. Еще два члена, встречающиеся у большинства позвоночных, принадлежат к одному семейству: B-Raf и A-Raf . Помимо разной длины их неконсервативных N- и C-концевых концов, все они имеют одинаковую доменную архитектуру, структуру и регуляцию. По сравнению с относительно хорошо известными c-Raf и B-Raf, очень мало известно о точной функции A-Raf, но также считается, что он похож на два других члена семейства. Считается, что все эти гены являются продуктом полных дупликаций генов или геномов на заре эволюции позвоночных из одного предкового гена Raf. Большинство других животных организмов обладают только одним геном Raf. Он называется Phl или Draf у Drosophila и Lin-45 у C. elegans.

Семейство киназ Раф (схематические архитектуры)

Многоклеточные животные также имеют тип киназы, тесно связанный с Raf: это киназный супрессор Ras (KSR). У позвоночных, таких как млекопитающие, есть два паралоговых гена KSR вместо одного: KSR1 и KSR2 . Их C-концевой киназный домен очень похож на Raf (первоначально названный CA5 в KSR и CR3 в Raf), но N-концевой регуляторный регион отличается. Хотя они также имеют перед собой гибкий шарнир (CA4 в KSR) и домен C1 (CA3 в KSR), у KSR полностью отсутствует Ras-связывающий домен. Вместо этого у них есть уникальные регуляторные области на их N-концах, первоначально названные CA1 («консервативная область 1») и CA2. Долгое время структура домена CA1 оставалась загадкой. Однако в 2012 году структура области CA1 в KSR1 была решена: это оказался дивергентный домен SAM (стерильный альфа-мотив), дополненный coiled-coils (CC-SAM): предполагается, что это помогает KSR в мембране. привязка. KSR, подобно Rafs, также имеют двойные связывающие мотивы 14-3-3 (которые зависят от фосфорилирования), но также обладают новыми MAPK-связывающими мотивами на своих шарнирных участках. В типичной последовательности Phe-x-Phe-Pro (FxFP) эти мотивы важны для регуляции обратной связи киназ Raf в пути ERK1 / 2 . Согласно нашим текущим знаниям, KSR также участвуют в том же пути, что и Raf, хотя они играют только вспомогательную роль. Обладая очень низкой собственной киназной активностью, они долгое время считались неактивными, пока их каталитическая активность не была наконец продемонстрирована в последние годы. Но даже тогда они вносят незначительный вклад в фосфорилирование MKK1 и MKK2 . Основная роль KSR, по-видимому, заключается в обеспечении партнера для гетеродимеризации ферментов Raf, значительно облегчая их активацию посредством аллостерии. Подобные явления были описаны для других киназ MAP3. ASK2, например, сам по себе является плохим ферментом, и его активность, по-видимому, связана с гетеродимеризацией ASK1 / ASK2.

Раф-подобные киназы полностью отсутствуют у грибов. Но недавнее секвенирование других опистоконтов (например, Capsaspora owczarzaki ) выявило присутствие подлинных киназ Raf у одноклеточных эукариот. Следовательно, возможно, что белки Raf являются древним наследием и предки грибов вторично утратили Raf-зависимую передачу сигналов. Пути MAP-киназ грибов , которые гомологичны пути ERK1 / 2 млекопитающих (Fus3 и Kss1 в дрожжах), активируются связанными с MEKK киназами (например, Ste11 в дрожжах) вместо ферментов Raf.

Киназы Raf, обнаруженные в ретровирусах (таких как мышиный v-Raf), вторично происходят от соответствующих генов позвоночных их хозяев. Эти гены Raf кодируют сильно усеченные белки, в которых отсутствует весь N-концевой аутоингибиторный домен и связывающие мотивы 14-3-3. Известно, что такие серьезные усечения вызывают неконтролируемую активность киназ Raf: это как раз то, что может понадобиться вирусу для эффективного воспроизводства.

Регулирование деятельности

Представление художника об аутоингибированном состоянии c-Raf, усиленном связанными димерами белка 14-3-3, связанными с фосфорилированными двойными мотивами.

Как упоминалось выше, регуляция активности c-Raf сложна. Как «привратник» пути ERK1 / 2 , он контролируется множеством тормозных механизмов и обычно не может быть активирован за один шаг. Наиболее важный регуляторный механизм включает прямую физическую ассоциацию N-концевого аутоингибиторного блока с киназным доменом c-Raf. Это приводит к окклюзии каталитического сайта и полному отключению киназной активности. Это «закрытое» состояние может быть снято только в том случае, если автоингибирующий домен Raf задействует партнера, конкурирующего с его собственным киназным доменом, в первую очередь с GTP-связанным Ras. Таким образом, активированные малые G-белки могут разрушать внутримолекулярные взаимодействия: это приводит к конформационному изменению («открытию») c-Raf, необходимому для активации киназы и связывания субстрата.

Белки 14-3-3 также вносят вклад в аутоингибирование. Поскольку известно, что все белки 14-3-3 образуют конститутивные димеры, их сборки имеют два сайта связывания. Таким образом, димер действует как «молекулярные наручники», запирая их партнеров по связыванию на фиксированном расстоянии и в определенной ориентации. Когда точно расположенные двойные связывающие мотивы 14-3-3 задействованы одним димером белка 14-3-3 (например, 14-3-3 дзета), они замыкаются в конформации, которая способствует аутоингибированию и не допускает разъединения. аутоингибиторного и каталитического доменов. Эта «блокировка» c-Raf (и других Raf, а также KSR) контролируется фосфорилированием мотива. Нефосфорилированные связывающие мотивы 14-3-3 не связываются со своими партнерами: они должны сначала фосфорилироваться на консервативных серинах (Ser 259 и Ser 621) другими протеинкиназами. Наиболее важной киназой, участвующей в этом событии, является активированная TGF-бета киназа 1 (TAK1), а ферментами, предназначенными для удаления этих фосфатов, являются комплексы протеинфосфатазы 1 (PP1) и протеинфосфатазы 2A (PP2A).

Обратите внимание, что связывание 14-3-3 ферментов Raf не обязательно является ингибирующим: как только Raf открывается и димеризуется, 14-3-3 также могут связываться в транс , связывая две киназы и « сковывая наручниками» их вместе, чтобы усилить димер, вместо держать их подальше друг от друга. Существуют и другие способы взаимодействия 14-3-3 с c-Raf, но их роль недостаточно хорошо известна.

Димеризация - еще один важный механизм регуляции активности c-Raf, необходимый для фосфорилирования петли активации Raf . Обычно в димеризации участвуют только «открытые» киназные домены. В отличие от B-Raf, который легко образует гомодимеры с самим собой, c-Raf предпочитает гетеродимеризацию либо с B-Raf, либо с KSR1. Гомодимеры и гетеродимеры ведут себя одинаково. Структура домена гомодимерной киназы B-Raf четко показывает, что петли активации (которые контролируют каталитическую активность всех известных протеинкиназ) расположены в димере в активноподобной конформации. Это происходит из-за аллостерического эффекта связывания другой молекулы с «обратной» стороной киназы; такие димеры симметричны и имеют два частично активных каталитических центра. На этом этапе активность киназ Raf низкая и нестабильная.

Цикл активации белков Raf млекопитающих, представленный B-Raf (значительно упрощенный обзор, не показывающий все этапы).

Для достижения полной активности и стабилизации активного состояния активационная петля c-Raf должна быть фосфорилирована. Единственные известные в настоящее время киназы, выполняющие это действие, - это сами киназы семейства Raf. Но некоторые другие киназы, такие как PAK1, могут фосфорилировать другие остатки рядом с киназным доменом c-Raf: точная роль этих вспомогательных киназ неизвестна. В контексте c-Raf как c-Raf, так и KSR1 необходимы для стадии «трансфосфорилирования». Из-за архитектуры димеров это фосфорилирование может происходить только в транс (т.е. один димер фосфорилирует другой в четырехчленном переходном комплексе). Взаимодействуя с консервативными остатками Arg и Lys в киназном домене, фосфорилированные активационные петли изменяют конформацию и становятся упорядоченными, постоянно блокируя киназный домен в полностью активном состоянии до дефосфорилирования. Фосфорилированные петли активации также делают киназу нечувствительной к присутствию ее аутоингибиторного домена. KSR не могут пройти эту последнюю стадию, поскольку они пропускают какие-либо фосфорилируемые остатки в своих петлях активации. Но как только c-Raf полностью активирован, в этом больше нет необходимости: активные ферменты Raf теперь могут взаимодействовать со своими субстратами. Как и большинство протеинкиназ, c-Raf имеет несколько субстратов. БАД (Bcl - 2-atagonist гибели клеток) непосредственно фосфорилируется с-Raf, наряду с несколькими типами аденилатциклаз , миозина фосфатазы (MYPT), сердечной мышцы тропонина Т (TnTc) и т.д. белок ретинобластомы (PRB) и cdc25 фосфатазы также были предложены в качестве возможных подложек.

Наиболее важными мишенями всех ферментов Raf являются MKK1 (MEK1) и MKK2 (MEK2) . Хотя структура фермент-субстратного комплекса c-Raf: MKK1 неизвестна, ее можно точно смоделировать по образцу комплекса KSR2: MKK1. Здесь не происходит фактического катализа, но считается, что он очень похож на способ связывания Raf со своими субстратами. Основной интерфейс взаимодействия обеспечивается С-концевыми долями обоих киназных доменов; большая, неупорядоченная, богатая пролином петля, уникальная для MKK1 и MKK2, также играет важную роль в ее позиционировании по отношению к Raf (и KSR). Эти MKK фосфорилируются по крайней мере на двух сайтах в их петлях активации после связывания с Raf: это также активирует их. Мишенями каскада киназ являются ERK1 и ERK2, которые избирательно активируются MKK1 или MKK2. ERK имеют множество субстратов в клетках; они также способны перемещаться в ядро ​​для активации ядерных факторов транскрипции. Активированные ERK являются плейотропными эффекторами клеточной физиологии и играют важную роль в контроле экспрессии генов, участвующих в цикле клеточного деления, миграции клеток, ингибировании апоптоза и дифференцировке клеток.

Сопутствующие заболевания человека

Наследственные мутации c-Raf, связанные с увеличением функции, участвуют в некоторых редких, но тяжелых синдромах. Большинство этих мутаций включают изменения одной аминокислоты в одном из двух связывающих мотивов 14-3-3. Мутация c-Raf является одной из возможных причин синдрома Нунана : пораженные люди имеют врожденные пороки сердца, низкий и дисморфический рост и несколько других деформаций. Подобные мутации в c-Raf могут также вызывать родственное состояние, называемое синдромом LEOPARD (лентиго, электрокардиографические аномалии, глазной гипертелоризм, легочный стеноз, аномальные гениталии, задержка роста, глухота) со сложной ассоциацией дефектов.

Роль в раке

Хотя c-Raf очень явно способен к мутации в онкоген в экспериментальных условиях и даже в некоторых опухолях человека, его сестринская киназа B-Raf действительно играет важную роль в канцерогенезе у людей.

Мутации B-Raf

Примерно 20% всех исследованных образцов опухолей человека содержат мутированный ген B-Raf. Подавляющее большинство этих мутаций связано с заменой одной аминокислоты: Val 600 на Glu, и этот аберрантный генный продукт (BRAF-V600E) можно визуализировать с помощью иммуногистохимии для клинической молекулярной диагностики. Аберрация может имитировать фосфорилирование петли активации и - с помощью переход через все этапы управления при нормальной активации - немедленно сделать киназный домен полностью активным. Поскольку B-Raf может также активироваться посредством гомодимеризации, а c-Raf посредством гетеродимеризации, эта мутация имеет катастрофический эффект, превращая путь ERK1 / 2 в конститутивно активный и управляя неконтролируемым процессом деления клеток.

В качестве терапевтической мишени

Из-за важности мутаций Ras и B-Raf в онкогенезе было разработано несколько ингибиторов Raf для борьбы с раком, особенно против B-Raf, проявляющего мутацию V600E. Сорафениб был первым клинически полезным агентом, который представляет собой фармакологическую альтернативу для лечения ранее неизлечимых злокачественных новообразований, таких как почечно-клеточная карцинома и меланома. Следили за несколькими другими молекулами, такими как Вемурафениб , Регорафениб , Дабрафениб и т. Д.

К сожалению, АТФ-конкурентные ингибиторы B-Raf могут иметь нежелательный эффект при K-Ras-зависимом раке: они просто слишком селективны для B-Raf. Хотя они отлично ингибируют активность B-Raf в случае, если мутантный B-Raf является основным виновником, они также способствуют гомо- и гетеродимеризации B-Raf с самим собой и c-Raf. Это фактически усилит активацию c-Raf вместо ее ингибирования в случае, если нет мутации в каких-либо генах Raf, но их общий активаторный белок K-Ras является мутированным. Эта «парадоксальная» активация c-Raf вызывает необходимость скрининга на мутации B-Raf у пациентов (с помощью генетической диагностики) перед началом терапии ингибитором B-Raf.

Список взаимодействующих белков

Было показано, что C-Raf взаимодействует с:

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки