Вирусный вектор - Viral vector

Вирусные векторы - это инструменты, обычно используемые молекулярными биологами для доставки генетического материала в клетки . Этот процесс может происходить внутри живого организма ( in vivo ) или в культуре клеток ( in vitro ). Вирусы развили специализированные молекулярные механизмы для эффективного переноса своих геномов внутри клеток, которые они заражают. Доставка генов или другого генетического материала вектором называется трансдукцией, а инфицированные клетки описываются как трансдуцированные. Молекулярные биологи впервые использовали этот механизм в 1970-х годах. Пол Берг использовал модифицированный вирус SV40, содержащий ДНК бактериофага λ, для заражения клеток почек обезьяны, поддерживаемых в культуре.

Помимо использования в исследованиях молекулярной биологии, вирусные векторы используются для генной терапии и разработки вакцин .

Ключевые свойства вирусного вектора

Вирусные векторы адаптированы к их конкретным приложениям, но, как правило, обладают несколькими ключевыми свойствами.

• Безопасность : хотя вирусные векторы иногда создаются из патогенных вирусов, они модифицируются таким образом, чтобы минимизировать риск обращения с ними. Обычно это связано с удалением части вирусного генома, критической для репликации вируса . Такой вирус может эффективно инфицировать клетки, но после того, как инфекция произошла, требуется, чтобы вирус-помощник предоставил недостающие белки для производства новых вирионов .
• Низкая токсичность : вирусный вектор должен оказывать минимальное влияние на физиологию инфицированной клетки.
• Стабильность : некоторые вирусы генетически нестабильны и могут быстро перестраивать свои геномы. Это пагубно сказывается на предсказуемости и воспроизводимости работы, проводимой с использованием вирусного вектора, и избегается при их разработке.
• Специфичность по типу клеток : большинство вирусных векторов сконструированы так, чтобы инфицировать как можно более широкий диапазон типов клеток . Однако иногда предпочтительнее обратное. Вирусный рецептор можно модифицировать для нацеливания вируса на конкретный вид клетки. Вирусы, модифицированные таким образом, называются псевдотипами .
• Идентификация : вирусным векторам часто присваиваются определенные гены, которые помогают определить, какие клетки приняли вирусные гены. Эти гены называются маркерами . Обычный маркер - устойчивость к определенному антибиотику. Затем клетки можно легко выделить, поскольку те, которые не захватили гены вирусных векторов, не обладают устойчивостью к антибиотикам и поэтому не могут расти в культуре с присутствием соответствующего антибиотика.

Приложения

Фундаментальные исследования

Вирусные векторы первоначально были разработаны в качестве альтернативы трансфекции с голой ДНК для молекулярной генетики экспериментов. По сравнению с традиционными методами трансфекции (такими как осаждение фосфатом кальция ), трансдукция может гарантировать, что почти 100% клеток инфицированы, без серьезного воздействия на жизнеспособность клеток. Кроме того, некоторые вирусы интегрируются в геном клетки, способствуя стабильной экспрессии.

Белковые гены , кодирующие могут быть выражены с помощью вирусных векторов, как правило , чтобы изучить функцию конкретного белка. Вирусные векторы, особенно ретровирусы, стабильно экспрессирующие маркерные гены, такие как GFP , широко используются для постоянной маркировки клеток для отслеживания их и их потомства, например, в экспериментах по ксенотрансплантации , когда клетки, инфицированные in vitro , имплантируются животному-хозяину.

Встраивание гена , которое может быть выполнено с помощью вирусных векторов, дешевле в выполнении, чем нокаут гена . Но поскольку подавление гена , эффект, который может быть предназначен для вставки гена, иногда является неспецифическим и оказывает нецелевое воздействие на другие гены, он, следовательно, дает менее надежные результаты. Векторы животных-хозяев также играют важную роль .

Генная терапия

Генная терапия - это метод исправления дефектных генов, ответственных за развитие болезни. В будущем, генная терапия может обеспечить способ лечения генетических заболеваний , такие как тяжелый комбинированный иммунодефицит , муковисцидоз или даже гемофилии А . Поскольку эти заболевания возникают в результате мутаций в последовательности ДНК определенных генов, в исследованиях генной терапии использовались вирусы для доставки немутантных копий этих генов в клетки тела пациента. Генная терапия добилась огромных успехов в лабораторных условиях. Однако необходимо решить несколько проблем вирусной генной терапии, прежде чем она получит широкое распространение. Иммунный ответ на вирусы не только препятствует доставке генов к клеткам-мишеням, но может вызвать серьезные осложнения для пациента. В одном из первых испытаний генной терапии в 1999 году это привело к смерти Джесси Гелсингера , которого лечили с помощью аденовирусного вектора.

Некоторые вирусные векторы, например гамма-ретровирусы , вставляют свои геномы в кажущееся случайным место на одной из хромосом хозяина , что может нарушить функцию клеточных генов и привести к раку. В испытании генной терапии ретровирусом тяжелого комбинированного иммунодефицита , проведенном в 2002 году, у четырех пациентов в результате лечения развился лейкоз; трое пациентов выздоровели после химиотерапии. В этом отношении векторы на основе аденоассоциированного вируса намного безопаснее, поскольку они всегда интегрируются в одном и том же месте в геноме человека, что позволяет применять их при различных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера .

Вакцина

Живой вакцинный вектор представляет собой вакцина , которая использует организм ( как правило , вирус или бактерию) , который не вызывает заболевания для транспортировки патогенных генов в организм для того , чтобы стимулировать иммунный ответ . Вирусы, экспрессирующие патогенные белки, в настоящее время разрабатываются в качестве вакцин против этих патогенов, исходя из тех же соображений, что и ДНК-вакцины . Гены , используемые в таких вакцин, как правило , антиген - кодирующих поверхностные белки из патогенного организма. Затем они вставляются в геном непатогенного организма, где они экспрессируются на поверхности организма и могут вызывать иммунный ответ.

В отличие от аттенуированных вакцин , вирусные векторные вакцины лишены других генов патогенов, необходимых для репликации, поэтому заражение патогеном невозможно. Аденовирусы активно развиваются как вакцинные векторы.

Доставка лекарств

Штамм вируса оспы канареек, модифицированный для переноса кошачьего интерлейкина-2 , используется для лечения кошек с фибросаркомой .

Типы

Ретровирусы

Ретровирусы - одна из опор современных подходов к генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как вирус лейкемии мышей Молони, обладают способностью стабильно интегрироваться в геном хозяина. Они содержат обратную транскриптазу для создания ДНК-копии генома РНК и интегразу, которая позволяет интегрироваться в геном хозяина . Они использовались в ряде одобренных FDA клинических испытаний, таких как исследование SCID-X1 .

Ретровирусные векторы могут быть репликационно-компетентными или репликационно-дефектными. Векторы с дефектом репликации являются наиболее распространенным выбором в исследованиях, поскольку у вирусов кодирующие области для генов, необходимых для дополнительных раундов репликации и упаковки вириона, были заменены другими генами или удалены. Эти вирусы способны инфицировать свои клетки-мишени и доставлять свою вирусную нагрузку, но затем не могут продолжать типичный литический путь, который приводит к лизису и гибели клеток.

Напротив, компетентные к репликации вирусные векторы содержат все необходимые гены для синтеза вирионов и продолжают размножаться после заражения. Поскольку вирусный геном для этих векторов намного длиннее, длина фактически вставленного интересующего гена ограничена по сравнению с возможной длиной вставки для векторов с дефектом репликации. В зависимости от вирусного вектора типичная максимальная длина допустимой вставки ДНК в вирусном векторе с дефектом репликации обычно составляет около 8-10 килобайт. Хотя это ограничивает введение многих геномных последовательностей, большинство последовательностей кДНК все же можно приспособить.

Основной недостаток использования ретровирусов, таких как ретровирус Молони, заключается в необходимости активного деления клеток для трансдукции . В результате клетки, такие как нейроны , очень устойчивы к инфекции и трансдукции ретровирусами.

Есть опасения, что инсерционный мутагенез из-за интеграции в геном хозяина может привести к раку или лейкемии . Эта проблема оставалась теоретической до тех пор, пока генная терапия десяти пациентов с SCID-X1 с использованием вируса мышиного лейкоза Молони не привела к двум случаям лейкемии, вызванной активацией онкогена LMO2 из-за соседней интеграции вектора.

Лентивирусы

Лентивирусы - это подкласс ретровирусов. Иногда их используют в качестве векторов для генной терапии благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, что является уникальной особенностью лентивирусов, поскольку другие ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки. Вирусный геном в форме РНК подвергается обратной транскрипции, когда вирус входит в клетку для производства ДНК , которая затем вставляется в геном в случайном месте (недавние открытия фактически предполагают, что внедрение вирусной ДНК не случайно, а направлено на специфические активные гены и связанные с организацией генома) вирусным ферментом интегразы . Вектор, который теперь называется провирусом , остается в геноме и передается потомству клетки при делении. Пока нет методов определения места интеграции, которые могут создать проблему. Провируса может нарушить функцию клеточных генов и привести к активации онкогенов , способствующим развитию от рака , который поднимает проблемы для возможного применения лентивирусов в генной терапии. Однако исследования показали, что лентивирусные векторы имеют меньшую тенденцию к интеграции в местах, потенциально вызывающих рак, чем гамма-ретровирусные векторы. В частности, одно исследование показало, что лентивирусные векторы не вызывали ни увеличения заболеваемости опухолями, ни более раннего возникновения опухолей у линии мышей с гораздо более высокой заболеваемостью опухолями. Более того, клинические испытания, в которых использовались лентивирусные векторы для доставки генной терапии для лечения ВИЧ, не показали увеличения мутагенных или онкологических явлений.

По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут гены, необходимые для их репликации. Для получения лентивирус, несколько плазмид , которые трансфицируют в так называемой упаковочной клеточной линии , обычно НЕК 293 . Одна или несколько плазмид, обычно называемых упаковывающими плазмидами, кодируют белки вириона , такие как капсид и обратная транскриптаза . Другая плазмида содержит генетический материал, который должен быть доставлен вектором. Он транскрибируется для получения вирусного генома с одноцепочечной РНК и маркируется наличием последовательности ψ (psi). Эта последовательность используется для упаковки генома в вирион.

Аденовирусы

В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется при делении клеток. Это ограничивает их использование в фундаментальных исследованиях, хотя аденовирусные векторы все еще используются в экспериментах in vitro, а также in vivo . Их основное применение - генная терапия и вакцинация . Поскольку люди обычно контактируют с аденовирусами , которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, у большинства пациентов уже выработаны нейтрализующие антитела, которые могут инактивировать вирус до того, как он достигнет клетки-мишени. Чтобы решить эту проблему, ученые в настоящее время исследуют аденовирусы, которые инфицируют различные виды, к которым люди не имеют иммунитета, например, аденовирус шимпанзе, используемый в качестве вектора для переноса гена шипа SARS - CoV - 2 в вакцине Oxford AstraZeneca COVID.

Аденоассоциированные вирусы

Аденоассоциированный вирус (AAV) - небольшой вирус, поражающий людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время не известно, что AAV вызывает заболевание и вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и может включать свой геном в геном клетки-хозяина. Более того, AAV в основном остается эписомальным (реплицируется без включения в хромосому); выполняя долгое и стабильное выражение. Эти особенности делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии. Однако AAV может передавать только до 5 КБ, что значительно меньше первоначальной емкости AAV.

Кроме того, из-за его потенциального использования в качестве вектора для генной терапии исследователи создали измененный AAV, названный самокомплементарным аденоассоциированным вирусом (scAAV). В то время как AAV упаковывает одну цепь ДНК и требует процесса синтеза второй цепи, scAAV упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе с образованием двухцепочечной ДНК. Пропуск синтеза второй цепи scAAV обеспечивает быструю экспрессию в клетке. В остальном scAAV обладает многими характеристиками своего аналога AAV.

Вирусы растений

Вирусы растений можно использовать для создания вирусных векторов, инструментов, обычно используемых для доставки генетического материала в клетки растений ; они также являются источниками биоматериалов и нанотехнологических устройств. Вирус табачной мозаики (TMV) - первый обнаруженный вирус. Вирусные векторы, основанные на вирусе табачной мозаики, включают векторы технологий экспрессии растений magnICON и TRBO.

Гибриды

Гибридные векторы - это векторные вирусы , которые с помощью генной инженерии обладают качествами более чем одного вектора. Вирусы изменяют, чтобы избежать недостатков типичных вирусных векторов, которые могут иметь ограниченную нагрузочную способность, иммуногенность, генотоксичность и не поддерживать долгосрочную адекватную трансгенную экспрессию . За счет замены нежелательных элементов желаемыми способностями гибридные векторы могут в будущем превзойти стандартные векторы трансфекции с точки зрения безопасности и терапевтической эффективности.

Проблемы в приложении

Выбор вирусного вектора для доставки генетического материала в клетки сопряжен с некоторыми логистическими проблемами. Существует ограниченное количество вирусных векторов, доступных для терапевтического использования. Любой из этих нескольких вирусных векторов может вызвать в организме развитие иммунного ответа, если вектор рассматривается как чужеродный захватчик. После использования вирусный вектор не может быть эффективно использован снова у пациента, потому что он будет распознаваться организмом. Если вакцина или генная терапия не пройдут клинические испытания , вирус не может быть снова использован у пациента для другой вакцины или генной терапии в будущем.

У пациента также может присутствовать ранее существовавший иммунитет против вирусного вектора, что делает терапию неэффективной для этого пациента. Поскольку праймирование вакциной « голая ДНК» и усиление вирусным вектором приводит к устойчивому иммунному ответу с помощью еще неопределенного механизма (ов), несмотря на ранее существовавший иммунитет к вирусному вектору, эта стратегия вакцинации может противодействовать этой проблеме. Однако этот метод может стать причиной дополнительных затрат и препятствий в процессе распространения вакцины. Существующий ранее иммунитет также можно поставить под сомнение, увеличив дозу вакцины или изменив способ вакцинации .

Некоторые недостатки вирусных векторов (такие как генотоксичность и низкая трансгенная экспрессия) можно преодолеть с помощью гибридных векторов .

Смотрите также

• Вирусная трансформация

использованная литература

дальнейшее чтение

• Торашима, Т .; Koyama, C .; Higashida, H .; Хираи, Х. (2007). «Производство нейрон-предпочтительных лентивирусных векторов». Обмен протоколами . DOI : 10.1038 / nprot.2007.89 .
• Okada, Y .; Икава, М. (2007). «Манипуляции с плацентарными генами путем трансдукции бластоцисты, свободной от зоны, с использованием лентивирусного вектора». Обмен протоколами . DOI : 10.1038 / nprot.2007.62 .
• Фрай Дж. У., Вуд К. Дж. (8 июня 1999 г.). «Сравнение векторов, используемых для клинического переноса генов» . Обзоры экспертов в области молекулярной медицины .