3D-культивирование клеток с помощью магнитной левитации - 3D cell culturing by magnetic levitation
Трехмерное культивирование клеток методом магнитной левитации (MLM) - это применение выращивания трехмерной ткани путем индуцирования клеток, обработанных сборками магнитных наночастиц, в пространственно изменяющихся магнитных полях с использованием неодимовых магнитных драйверов и стимулирования межклеточного взаимодействия путем левитации клеток в воздухе / жидкая поверхность стандартной чашки Петри . Сборки магнитных наночастиц состоят из магнитных наночастиц оксида железа, наночастиц золота и полимера полилизина . Трехмерное культивирование клеток является масштабируемым, с возможностью культивирования от 500 клеток до миллионов клеток или от одной чашки до высокопроизводительных систем малого объема. После создания намагниченных культур их также можно использовать в качестве строительного материала или «чернил» для процесса магнитной трехмерной биопечати .
Обзор
Стандартное однослойное культивирование клеток на пластике для тканевых культур заметно улучшило наше понимание базовой биологии клетки, но оно не воспроизводит сложную трехмерную архитектуру ткани in vivo и может значительно изменить свойства клеток. Это часто ставит под угрозу эксперименты в области фундаментальных наук о жизни, приводит к неверным результатам скрининга лекарств на эффективность и токсичность и приводит к образованию клеток, которые могут не обладать характеристиками, необходимыми для разработки методов лечения регенерации тканей.
Будущее культивирования клеток для фундаментальных исследований и биомедицинских приложений заключается в создании многоклеточной структуры и организации в трех измерениях. Многие схемы для трехмерного культивирования разрабатываются или продаются, например, биореакторы или гелевые среды на основе белков.
Система трехмерного культивирования клеток, известная как Bio-Assembler, использует биосовместимые реагенты на основе полимеров для доставки магнитных наночастиц к отдельным клеткам, так что примененный магнитный привод может поднимать клетки над дном чашки для культивирования клеток и быстро объединять клетки рядом с воздухом. жидкая граница раздела. Это инициирует межклеточные взаимодействия в отсутствие какой-либо искусственной поверхности или матрикса . Магнитные поля предназначены для быстрого формирования трехмерных многоклеточных структур всего за несколько часов, включая экспрессию белков внеклеточного матрикса . Морфологии , экспрессии белка , и ответ на экзогенные агент в результате тканей показывают большое сходство с результатами в естественных условиях.
История
Трехмерное культивирование клеток методом магнитной левитации (MLM) было разработано в результате сотрудничества ученых из Университета Райса и Центра рака Андерсона Университета Техаса в 2008 году. С тех пор эта технология была лицензирована и коммерциализирована Nano3D Biosciences.
Процесс магнитной левитации
Выше приведено изображение, показывающее трехмерное культивирование клеток посредством магнитной левитации с помощью системы культивирования клеток Bio-Assembler. (A) Сборка магнитных наночастиц оксида железа, известная как Nanoshuttle, добавляется и диспергируется по клеткам, и смесь инкубируется. (B) После инкубации с Nanoshuttle клетки отделяют и переносят в чашку Петри. (C) Магнитный привод затем помещается на верхнюю часть чашки Петри. (D) Магнитное поле заставляет клетки подниматься к границе раздела воздух-среда. (E) Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) левитировали в течение 60 минут (изображения слева) и 4 часов (изображения справа) (шкала масштаба 50 мкм). Начало межклеточного взаимодействия происходит, как только клетки левитируют и начинают формироваться трехмерные структуры. Через 1 час клетки все еще относительно рассредоточены, но уже проявляют некоторые признаки растяжения. Формирование трехмерных структур видно после 4 часов левитации (стрелки).
Экспрессия белка
Экспрессия белка в левитированных культурах демонстрирует поразительное сходство с паттернами in vivo. Экспрессия N-кадгерина в левитированных клетках глиобластомы человека была идентична экспрессии, наблюдаемой в ксенотрансплантатах опухоли человека, выращенных у иммунодефицитных мышей, в то время как стандартная 2D-культура показывала гораздо более слабую экспрессию, которая не соответствовала распределению ксенотрансплантатов, как показано на рисунке ниже. Трансмембранный белок N-кадгерин часто используется в качестве индикатора сборки ткани, подобной in vivo, при трехмерном культивировании.
На изображении выше, распределение N-кадгерина (красный) и ядер (синий) в ксенотрансплантате мыши с раком мозга человека (слева, раковые клетки мозга человека, выращенные в мозге мыши ), раковые клетки мозга, культивированные с помощью трехмерной магнитной левитации в течение 48 часов. (в центре) и клетки, культивируемые на покровном стекле (2D, справа). 2D-система показывает N-кадгерин в цитоплазме и ядре и заметно отсутствует на мембране, тогда как в левитированной культуре и мыши N-кадгерин явно сконцентрирован в мембране, а также присутствует в цитоплазме и соединениях клеток.
Приложения
Совместное культивирование, магнитные манипуляции и анализы инвазии
Одной из проблем создания in vivo подобных культур или тканей in vitro является сложность совместного культивирования различных типов клеток. Благодаря способности трехмерного культивирования клеток с помощью магнитной левитации объединять клетки, совместное культивирование клеток возможно. Совместное культивирование различных типов клеток может быть достигнуто в начале левитации путем смешивания различных типов клеток перед левитацией или путем магнитного управления 3D-культурами в формате анализа инвазии.
Уникальная способность манипулировать клетками и формировать ткани магнитным способом предлагает новые возможности для контролируемого совместного культивирования и анализов инвазии. Совместное культивирование в реалистичной архитектуре ткани имеет решающее значение для точного моделирования условий in vivo, например, для повышения точности клеточных анализов, как показано на рисунке ниже.
На картинке выше показан анализ вторжения многоклеточных сфероидов, находящихся на магнитной левитации. Флуоресцентные изображения клеток глиобластомы человека (GBM) (зеленый; GFP-экспрессирующие клетки) и нормальных астроцитов человека (NHA) (красный; меченные mCherry), культивируемых отдельно, а затем совместно управляемых магнитным полем (слева, время 0). Вторжение GBM в NHA в 3D-культуре представляет собой новый мощный метод анализа базовой биологии рака и скрининга лекарств (справа, от 12 до 252 часов).
Моделирование сосудов стволовыми клетками
Облегчая сборку различных популяций клеток с помощью MLM, может быть достигнута последовательная генерация органоидов, называемых адипосферами, способных моделировать сложные межклеточные взаимодействия эндогенной белой жировой ткани (WAT).
Совместное культивирование преадипоцитов 3T3-L1 в 3D с мышиными эндотелиальными клетками bEND.3 создает сосудисто-подобную сборку сети с сопутствующим липогенезом в периваскулярных клетках. См. Рисунок ниже.
Помимо клеточных линий, органогенез WAT можно моделировать из первичных клеток.
Истощенную адипоцитами стромальную сосудистую фракцию (SVF), содержащую жировые стромальные клетки (ASC), эндотелиальные клетки и инфильтрирующие лейкоциты, полученные из белой жировой ткани мыши (WAT), культивировали в 3D. Это выявило органоиды с поразительной иерархической организацией с отчетливой капсулой и внутренними крупными сосудистыми структурами, выстланными эндотелиальными клетками, а также периваскулярную локализацию ASC.
При индукции адипогенеза либо адипосфер 3T3-L1, либо адипосфер, полученных из SVF, клетки эффективно образовывали большие липидные капли, типичные для белых адипоцитов in vivo, тогда как образование липидных капель меньшего размера возможно в 2D. Это указывает на межклеточную передачу сигналов, которая лучше воспроизводит органогенез WAT.
Этот MLM для совместного культивирования в 3D создает адипосферы, подходящие для моделирования WAT ex vivo, и предоставляет новую платформу для функциональных скринингов для идентификации молекул, биоактивных по отношению к отдельным популяциям жировых клеток. Его также можно использовать для трансплантации WAT и других подходов к клеточной терапии на основе WAT.
Организованное совместное культивирование для создания ткани, подобной in vivo.
Используя MagPen (продукт Nano3D Biosciences, Inc.), можно быстро создать организованные совместные культуры 3D, аналогичные архитектуре нативных тканей. Эндотелиальные клетки (PEC), гладкомышечные клетки (SMC), фибробласты (PF) и эпителиальные клетки (EpiC), культивируемые с помощью Bio-Assembler, могут быть последовательно наслоены методом перетаскивания для создания бронхиол, которые поддерживают фенотип и индуцируют образование внеклеточного матрикса.
Типы клеток культивируются
Ниже перечислены типы клеток (первичные и клеточные линии), которые были успешно культивированы методом магнитной левитации. Вторая таблица такая же, но с изображениями. Другие изображения доступны на сайте Nano3D Biosciences, Inc.
Клетки | Клеточная линия | Организм | Ткань органа |
---|---|---|---|
Мышиный эндотелиальный | Клеточная линия | Мышь | Судно |
Мышиный адипоцит | Клеточная линия | Мышь | Жировой |
Rattus погуе гепатомы | Клеточная линия | Крыса | Печень |
Легочные фибробласты (HPF) | Начальный | Человек | Легкое |
Легочный эндотелиальный (HPMEC) | Начальный | Человек | Легкое |
Эпителиальный слой малых дыхательных путей (HSAEpiC) | Начальный | Человек | Легкое |
Бронхиальный эпителиальный | Начальный | Человек | Легкое |
Альвеолярная аденокарцинома человека | A549 | Человек | Легкое |
Альвеолярный тип II | Начальный | Человек | Легкое |
Гладкая мышца трахеи (HTSMC) | Начальный | Человек | Легкое |
Мезенхимальные стволовые клетки (HMSC) | Начальный | Человек | Костный мозг |
Эндотелиальные клетки костного мозга (HBMEC) | Начальный | Человек | Костный мозг |
Стволовые клетки пульпы зуба | Начальный | Человек | |
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) | Начальный | Человек | |
Хондроциты мыши | Начальный | Мышь | Кость |
Жировая ткань мыши | Начальный | Мышь | |
Эндотелиальный клапан сердечного клапана | Начальный | Свиной | |
Преадипоциты фибробласты | 3T3 | Мышь | |
Нервные стволовые клетки | C17.2 | Мышь | Мозг |
Эмбриональные клетки почек человека | HEK293 | Человек | Почка |
Меланома | B16 | Мышь | Кожа |
Астроциты | NHA | Человек | Мозг |
Глиобластомы | LN229 | Человек | Мозг |
Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки | Человек | ||
Эпителиальный эпителий молочной железы | MCF10A | Человек | Грудь |
Рак молочной железы | MDA231 | Человек | Грудь |
Остеосаркома | MG63 | Человек | Кость |
Та же таблица, что и выше, но с изображениями.
Клетки | Клеточная линия | Организм | Ткань органа | Изображение |
---|---|---|---|---|
Мышиный эндотелиальный | Клеточная линия | Мышь | Судно | |
Мышиный адипоцит | Клеточная линия | Мышь | Жировой | |
Rattus погуе гепатомы | Клеточная линия | Крыса | Печень | |
Легочные фибробласты (HPF) | Начальный | Человек | Легкое | |
Легочный эндотелиальный (HPMEC) | Начальный | Человек | Легкое | |
Эпителиальный слой малых дыхательных путей (HSAEpiC) | Начальный | Человек | Легкое | |
Бронхиальный эпителиальный | Начальный | Человек | Легкое | |
Альвеолярная аденокарцинома человека | A549 | Человек | Легкое | |
Альвеолярный тип II | Начальный | Человек | Легкое | |
Гладкая мышца трахеи (HTSMC) | Начальный | Человек | Легкое | |
Мезенхимальные стволовые клетки (HMSC) | Начальный | Человек | Костный мозг | |
Эндотелиальные клетки костного мозга (HBMEC) | Начальный | Человек | Костный мозг | |
Стволовые клетки пульпы зуба | Начальный | Человек | ||
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) | Начальный | Человек | ||
Хондроциты мыши | Начальный | Мышь | Кость | |
Жировая ткань мыши | Начальный | Мышь | ||
Эндотелиальный клапан сердечного клапана | Начальный | Свиной | ||
Преадипоциты фибробласты | 3T3 | Мышь | ||
Нервные стволовые клетки | C17.2 | Мышь | Мозг | |
Эмбриональные клетки почек человека | HEK293 | Человек | Почка | |
Меланома | B16 | Мышь | Кожа | |
Астроциты | NHA | Человек | Мозг | |
Глиобластомы | LN229 | Человек | Мозг | |
Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки | Человек | |||
Эпителиальный эпителий молочной железы | MCF10A | Человек | Грудь | |
Рак молочной железы | MDA231 | Человек | Грудь | |
Остеосаркома | MG63 | Человек | Кость |