Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия - Differential interference contrast microscopy
Микроскопия дифференциального интерференционного контраста ( ДИК ) , также известная как интерференционный контраст Номарского ( NIC ) или микроскопия Номарского , представляет собой метод оптической микроскопии , используемый для увеличения контраста в неокрашенных прозрачных образцах . DIC работает по принципу интерферометрии, чтобы получить информацию о длине оптического пути образца, чтобы увидеть невидимые детали. Относительно сложная оптическая система позволяет получить изображение объекта от черного до белого на сером фоне. Это изображение похоже на изображение, полученное с помощью фазово-контрастной микроскопии, но без яркого дифракционного ореола. Методика была разработана польским физиком Жоржем Номарски в 1952 году.
DIC работает путем разделения поляризованного источника света на две ортогонально поляризованные взаимно когерентные части, которые пространственно смещаются (срезаются) в плоскости образца и рекомбинируются перед наблюдением. Интерференция двух частей при рекомбинации чувствительна к разнице их оптических путей (т. Е. Произведению показателя преломления и геометрической длины пути). При добавлении регулируемой фазы смещения, определяющей интерференцию при нулевой разнице оптического пути в образце, контраст пропорционален градиенту длины пути вдоль направления сдвига, создавая появление трехмерного физического рельефа, соответствующего изменению оптической плотности образец, подчеркивая линии и края, но не обеспечивая топографически точного изображения.
Световой путь
1. Неполяризованный свет попадает в микроскоп и поляризуется под углом 45 °.
- Для работы техники необходим поляризованный свет.
2. Поляризованный свет проникает в первую призму Волластона, модифицированную по Номарски, и разделяется на два луча, поляризованных под углом 90 ° друг к другу, - эталонный и эталонный.
- Призмы Волластона представляют собой тип призмы, состоящей из двух слоев кристаллического вещества, такого как кварц, который из-за изменения показателя преломления в зависимости от поляризации света разделяет свет в соответствии с его поляризацией. Призмы Nomarski вызывает два луча , чтобы прийти к фокальной точке за пределами тела призмы, и так обеспечивают большую гибкость при настройке микроскопа, так как призма может быть активно сфокусированным.
3. Два луча фокусируются конденсатором для прохождения через образец. Эти два луча фокусируются таким образом, что они проходят через две соседние точки в образце, расстояние между которыми составляет около 0,2 мкм.
- Образец эффективно освещается двумя когерентными источниками света, один с поляризацией 0 °, а другой - с поляризацией 90 °. Однако эти две подсветки не совсем выровнены, одна из которых немного смещена по отношению к другой.
4. Лучи проходят через смежные области образца, разделенные сдвигом. Разделение обычно аналогично разрешению микроскопа. У них будет различная длина оптического пути, где области различаются по показателю преломления или толщине. Это вызывает изменение фазы одного луча относительно другого из-за задержки, испытываемой волной в более оптически плотном материале.
- Прохождение множества пар лучей через пары соседних точек в образце (и их поглощение, преломление и рассеяние образцом) означает, что изображение образца теперь будет переноситься поляризованным светом как под углом 0 °, так и с углом 90 °. Если рассматривать их по отдельности, это будут изображения образца в ярком поле , слегка смещенные друг относительно друга. Свет также несет информацию об изображении, невидимом для человеческого глаза, о фазе света. Это жизненно необходимо позже. Различная поляризация предотвращает интерференцию между этими двумя изображениями на данном этапе.
5. Лучи проходят через линзу объектива и фокусируются второй призмой Волластона, модифицированной Номарским.
6. Вторая призма объединяет два луча в один, поляризованный под углом 135 °. Комбинация лучей приводит к интерференции , осветлению или затемнению изображения в этой точке в зависимости от разницы оптических путей.
- Эта призма накладывает два изображения в ярком поле и выравнивает их поляризацию, чтобы они могли мешать друг другу. Однако изображения не совсем совпадают из-за смещения освещения - это означает, что вместо интерференции между двумя лучами света, прошедшими через одну и ту же точку в образце, возникает интерференция между лучами света, прошедшими через соседние точки, которые поэтому есть немного другая фаза. Поскольку разница в фазе возникает из-за разницы в длине оптического пути, эта рекомбинация света вызывает «оптическую дифференциацию » длины оптического пути, создавая видимое изображение.
Изображение
Изображение имеет вид трехмерного объекта при очень наклонном освещении, вызывающем сильные светлые и темные тени на соответствующих лицах. Направление видимого освещения определяется ориентацией призм Волластона.
Как объяснено выше, изображение создается из двух идентичных изображений в светлом поле, наложенных друг на друга с небольшим смещением (обычно около 0,2 мкм), и последующей интерференции из-за разности фаз, преобразующей изменения фазы (и, следовательно, длины оптического пути) в видимый изменение в темноте. Это вмешательство может быть как конструктивным, так и деструктивным, вызывая характерный вид трех измерений.
Типичная разность фаз, вызывающая помехи, очень мала и очень редко превышает 90 ° (четверть длины волны). Это происходит из-за схожести показателей преломления большинства образцов и среды, в которой они находятся: например, ячейка в воде имеет разность показателей преломления только около 0,05. Эта небольшая разность фаз важна для правильной работы ДИК, поскольку, если разность фаз на стыке между двумя веществами слишком велика, разность фаз может достигать 180 ° (половина длины волны), что приводит к полной деструктивной интерференции и аномальной темноте. область, край; если бы разность фаз достигла 360 ° (полная длина волны), это привело бы к полной конструктивной интерференции, создавая аномально яркую область.
Изображение можно аппроксимировать (пренебрегая преломлением и поглощением из-за образца и пределом разрешения разделения лучей) как разность длины оптического пути по отношению к положению поперек образца вдоль сдвига и, таким образом, дифференциал показателя преломления (оптический плотность) образца.
Контраст можно регулировать с помощью фазы смещения, либо перемещая призму Номарского объектива, либо с помощью волновой пластины лямбда / 4 между поляризатором и конденсорной призмой Нормарского (компенсация Де-Сенармона). Результирующий контраст меняется от темного поля для нулевого сдвига фазы (интенсивность пропорциональна квадрату дифференциала сдвига) к типичному рельефу, наблюдаемому для фазы ~ 5–90 градусов, к оптическому окрашиванию на 360 градусов, где длина волны затухания сдвигается с разностью фаз.
Когда последовательно смещенные изображения сопоставляются, сдвиг фазы, вносимый объектом, может быть отделен от нежелательных неинтерферометрических артефактов, что обычно приводит к улучшению контрастности, особенно в мутных образцах.
Приложения
ДВС используется для визуализации живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазок из культуры ткани или отдельных одноклеточных организмов, переносимых водой. Его разрешение и четкость в таких условиях не имеют себе равных среди стандартных методов оптической микроскопии.
Одна небиологическая область, где используется ДИК, - это анализ обработки планарных кремниевых полупроводников. Тонкие (обычно 100–1000 нм) пленки при обработке кремния часто в основном прозрачны для видимого света (например, диоксида кремния, нитрида кремния и поликристаллического кремния), и дефекты в них или загрязнения, лежащие на них, становятся более заметными. Это также позволяет определить, является ли элемент ямкой в материале подложки или пятном постороннего материала наверху. Травленые кристаллические элементы приобретают особенно эффектный вид при ДИК.
Качество изображения при использовании в подходящих условиях является выдающимся по разрешению и почти полностью свободным от артефактов, в отличие от фазового контраста. Однако при анализе изображений DIC необходимо всегда учитывать ориентацию призм Волластона и видимое направление освещения, поскольку параллельные ему элементы не будут видны. Однако это легко преодолеть, просто повернув образец и наблюдая за изменениями изображения.
Смотрите также
Рекомендации
- Мерфи Д., Дифференциальная интерференционная контрастная (ДИК) микроскопия и микроскопия с модуляционным контрастом, в Основах световой микроскопии и цифровой обработки изображений, Wiley-Liss, Нью-Йорк, стр. 153–168 (2001).
- Салмон, Э. и Тран, П., Световой микроскоп дифференциального интерференционного контраста (VE-DIC) с повышенным разрешением видео., Видеомикроскопия, Слудер, Г. и Вольф, Д. (редакторы), Academic Press, Нью-Йорк, С. 153–184 (1998).
- Дифференциальный интерференционный контраст - ссылки
Внешние ссылки
|
Ресурсы библиотеки о дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии |