Быстрый параллельный протеолиз - Fast parallel proteolysis
Быстрый параллельный протеолиз ( FASTpp ) представляет собой метод для определения термостабильности из белков пути измерения которого доля белка сопротивляется быстрое протеолитическое пищеварение.
История и предыстория
Протеолиз широко используется в биохимии и клеточной биологии для исследования структуры белка . При «ограниченном протеолизе трипсина» небольшое количество протеазы переваривает свернутый и развернутый белок, но в значительной степени с разной скоростью: неструктурированные белки разрезаются быстрее, а структурированные белки разрезаются медленнее (иногда на порядки). Недавно было предложено несколько других анализов стабильности белков, основанных на протеолизе, с использованием других протеаз с высокой специфичностью для расщепления развернутых белков. К ним относятся импульсный протеолиз, протеолитическая сканирующая калориметрия и FASTpp.
Как это работает
FASTpp измеряет количество белка, который сопротивляется перевариванию в различных условиях. С этой целью используется термостабильная протеаза, которая расщепляет специфически открытые гидрофобные остатки. Анализ FASTpp сочетает в себе термическое разворачивание, специфичность термостабильной протеазы для развернутой фракции с разделяющей способностью SDS-PAGE . Благодаря этой комбинации FASTpp может обнаруживать изменения во фракции, свернутой в большом физико-химическом диапазоне условий, включая температуры до 85 ° C, pH 6-9, присутствие или отсутствие всего протеома . Применения варьируются от биотехнологии до изучения точечных мутаций и анализов связывания лигандов .
Приложения
FASTpp использовался для зондирования:
- Влияние лизата на стабильность белка
- Термическая стабильность протеома
- Парное фальцовка и переплет
- Влияние лиганда на свертывание и стабильность фракции
- Влияние мутаций на свертывание фракций и стабильность (например, точечные мутации / миссенс мутации )
- Кинетическая стабильность белка
Технология
Во-первых, клеточный лизат генерируется путем измельчения стеклянных шариков, гомогенизации под давлением или методами химического или физического лизиса, которые не денатурируют интересующий белок (белки). (Необязательно для целевого анализа) представляющий интерес белок очищают из этого лизата методами аффинности, основанными на изначально неупорядоченных метках или других подходящих стратегиях очистки, часто включающих несколько этапов ортогональной хроматографии.
Этот (общий или очищенный) раствор белка аликвотируют в несколько пробирок ПЦР-стрипа. Все аликвоты подвергаются параллельному воздействию в термостабильном цикле ПЦР с различными максимальными температурами в присутствии термостабильной протеазы термолизина (см. Рисунок). Автоматический контроль температуры достигается с помощью циклического устройства с температурным градиентом (обычно используется для ПЦР ). Продукты реакции можно разделить с помощью SDS-PAGE или вестерн-блоттинга . Термолизин протеазы может быть полностью инактивирован ЭДТА . Эта особенность термолизина делает FASTpp совместимым с последующим расщеплением трипсином, например, для масс-спектрометрии .