Кассета без G - G-less cassette
G-менее кассета транскрипция анализ является методом , используемым в молекулярной биологии для определения промотора силы в пробирке . Методика включает количественную оценку продукта мРНК с использованием плазмиды. Кассета без G является частью предварительно сконструированного вектора, обычно содержащего сайт множественного клонирования (MCS) перед кассетой. По этой причине интересующие промоторы могут быть вставлены непосредственно в MCS, чтобы в конечном итоге измерить точность и эффективность промотора в рекрутировании аппарата транскрипции.
кассетную плазмиду без G.
(a) Предварительно созданная плазмида с 365-нуклеотидной G-менее смысловой цепью подвергается вставке промотора. (b) Промотор клонируют в сайт множественного клонирования (MCS) непосредственно перед сайтом начала транскрипции. Для транскрипции кассеты без G используется полимераза. После того, как кассета была расшифрована и первый гуанозинтрифосфат в смысловой цепи за пределами кассеты обнаружен, транскрипция преждевременно прекращается. Выпущен 365-нуклеотидный транскрипт с радиоактивной меткой. Транскрипты, полученные в кассетном анализе без G, можно подвергнуть гель-электрофорезу для подтверждения их длины и авторадиографии для определения относительной силы промотора.
Метод
Кассета без G представляет собой репортерный ген, который кодирует транскрипт, лишенный нуклеотидов гуанина в смысловой цепи ДНК (отсюда «без G »). Плазмида, содержащая такой ген, расположена ниже MCS. После того, как промотор вставлен в MCS, транскрипция продолжается с добавлением радиоактивно меченных UTP, CTP и ATP (а также немеченых / холодных нуклеотидов) и продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец кассеты без G и не будут остатки гуанина. еще раз проявляется в смысловой цепи ДНК. Отсутствие GTP in vitro приводит к преждевременному прекращению транскрипции на первом остатке гуанина в смысловой цепи, следующей за кассетой. Гель-электрофорез проводят на продуктах транскрипции, и количество радиоактивности определяют количественно с помощью авторадиографии или фосфорного изображения для определения силы интересующего промотора.
заявка
Метод кассеты без G используется для определения силы промотора за пределами базальных уровней транскрипции (то есть в присутствии активаторов транскрипции или факторов транскрипции ). Например, для измерения эффектов модификации консенсусной последовательности ТАТА-бокса в Saccharomyces cerevisiae в присутствии TFIID были реализованы кассеты без G для измерения относительной силы каждого промотора.
Преимущества
Анализ без G можно проводить на кольцевой плазмиде для измерения уровней транскрипции. Кольцевая плазмида обеспечивает более эффективную матрицу во многих системах по сравнению с другими анализами, такими как текущая транскрипция, в которых требуется отщепленный конец. Этот метод очень эффективно генерирует радиоактивно меченые транскрипты, поскольку он позволяет обойти ненужный процесс выполнения других косвенных измерений продукта мРНК. Промотор вставляется в кольцевую плазмиду, содержащую кассету без G, которая будет генерировать транскрипт определенной длины, исключающий случайную и неспецифическую транскрипцию по всей плазмиде. Большинство неочищенных систем, таких как ядерные экстракты HeLa, используются, потому что они содержат небольшое количество загрязняющего GTP, что приводит к фоновой транскрипции и может иногда вызывать случайную транскрипцию для считывания через кассету без G.