Кристаллография с временным разрешением - Time resolved crystallography
Кристаллография с временным разрешением использует рентгеновскую кристаллографию для визуализации реакций в четырех измерениях (x, y, z и время). Это позволяет изучать динамические изменения, которые происходят, например, в ферментах во время их катализа. Измерение времени включается путем запуска интересующей реакции в кристалле до воздействия рентгеновских лучей , а затем сбора дифракционных картин с различными временными задержками. Для изучения этих динамических свойств макромолекул должны быть соблюдены три критерия;
- Макромолекула должна быть биологически активной в кристаллическом состоянии.
- Должна быть возможность вызвать реакцию в кристалле.
- Интересующий промежуточный продукт должен быть обнаруживаемым, т.е. он должен иметь разумную концентрацию в кристалле (предпочтительно более 25%).
Это привело к разработке нескольких методов, которые можно разделить на две группы: метод накачки-зонд и методы диффузионного захвата.
Насос-зонд
В методе накачки-зондирования реакция сначала запускается (накачка) фотолизом (чаще всего лазерным светом), а затем дифракционная картина собирается рентгеновским импульсом (зондом) с определенной временной задержкой. Это позволяет получить множество изображений с разными временными задержками после срабатывания реакции и, таким образом, построить хронологическую серию изображений, описывающих события во время реакции. Чтобы получить разумное отношение сигнал / шум, этот цикл накачки-зонд должен выполняться много раз для каждого пространственного вращения кристалла и много раз с той же временной задержкой. Следовательно, реакция, которую желают изучить с помощью насоса-зонда, должна иметь возможность расслабиться и вернуться к своей исходной конформации после запуска, что позволяет проводить много измерений на одном и том же образце. Временное разрешение наблюдаемых явлений определяется длительностью зондирующего импульса ( полная ширина на полувысоте ). Все процессы, которые происходят в более быстром масштабе времени, чем это, будут усреднены путем свертки интенсивности зондирующего импульса во времени с интенсивностью фактической отражательной способности рентгеновского излучения образца.
Захват диффузии
В способах диффузионного захвата используются методы диффузии для попадания субстратов в кристалл, после чего применяются различные методы захвата, чтобы заставить интересующий промежуточный продукт накапливаться в кристалле до сбора дифракционной картины. Эти методы улавливания могут включать изменение pH , использование ингибитора или понижение температуры, чтобы замедлить скорость оборота или, возможно, даже полностью остановить реакцию на определенной стадии. Просто запустить реакцию и затем быстро заморозить ее, тем самым погасив ее на определенном временном шаге, также является возможным методом. Одним из недостатков методов диффузионного улавливания является то, что их можно использовать только для изучения промежуточных продуктов, которые могут быть захвачены, тем самым ограничивая временное разрешение, которое можно получить с помощью этих методов, по сравнению с методом накачки-зондирования.