ЧИП-на-чипе - ChIP-on-chip
ChIP-on-chip (также известная как ChIP-chip ) - это технология, сочетающая иммунопреципитацию хроматина («ChIP») с ДНК-микрочипом ( «чипом» ). Как и обычный ChIP , ChIP-on-chip используется для исследования взаимодействий между белками и ДНК in vivo . В частности, он позволяет идентифицировать цистром , сумму сайтов связывания , для ДНК-связывающих белков на основе всего генома. Анализ всего генома может быть выполнен для определения местоположения сайтов связывания практически для любого интересующего белка. Как следует из названия метода, такие белки обычно действуют в контексте хроматина . Наиболее яркими представителями этого класса являются факторы транскрипции , белки, связанные с репликацией , такие как белок комплекса распознавания ориджина (ORC), гистоны , их варианты и модификации гистонов.
Цель ChIP-on-chip - найти сайты связывания с белками, которые могут помочь идентифицировать функциональные элементы в геноме . Например, в случае фактора транскрипции в качестве интересующего белка можно определить сайты связывания его фактора транскрипции по всему геному. Другие белки позволяют идентифицировать промоторные области , энхансеры , репрессоры и элементы сайленсинга , инсуляторы , граничные элементы и последовательности, которые контролируют репликацию ДНК. Если гистоны представляют интерес, считается, что распределение модификаций и их локализация может предложить новое понимание механизмов регуляции .
Одна из долгосрочных целей ChIP-on-chip была разработана для создания каталога (выбранных) организмов, в котором перечислены все взаимодействия белок-ДНК в различных физиологических условиях. Эти знания в конечном итоге помогут в понимании механизма регуляции генов, пролиферации клеток и прогрессирования заболевания. Следовательно, ChIP-on-Chip предлагает как потенциал, чтобы дополнить наши знания об оркестровке генома на уровне нуклеотидов, так и информацию о более высоких уровнях информации и регуляции, распространяемую исследованиями в области эпигенетики .
Технологические платформы
Технической платформой для проведения экспериментов с чипом на чипе являются ДНК-микрочипы , или «чипы» . Их можно классифицировать и различать по различным характеристикам:
Тип зонда : массивы ДНК могут содержать кДНК с механическими пятнами или продукты ПЦР , олигонуклеотиды с механическими пятнами или олигонуклеотиды, которые синтезируются in situ . Ранние версии микрочипов были разработаны для обнаружения РНК из экспрессируемых областей генома ( открытые рамки считывания, известные как ORF). Хотя такие массивы идеально подходят для изучения профилей экспрессии генов , они имеют ограниченное значение в экспериментах с ChIP, поскольку большинство «интересных» белков в отношении этого метода связываются в межгенных областях . В настоящее время даже массивы, изготовленные по индивидуальному заказу, можно проектировать и настраивать в соответствии с требованиями эксперимента. Кроме того, любая последовательность нуклеотидов может быть синтезирована для покрытия как генных, так и межгенных областей.
Размер зонда : ранние версии массивов кДНК имели длину зонда около 200 пар оснований. В последних версиях массивов используются олигонуклеотиды от 70- (Microarrays, Inc.) до 25-меров ( Affymetrix ). (Февраль 2007 г.)
Состав зонда : бывают мозаичные и нематериальные массивы ДНК. В не мозаичных массивах используются зонды, выбранные в соответствии с непространственными критериями, т. Е. Последовательности ДНК, используемые в качестве зондов, не имеют фиксированных расстояний в геноме. Однако мозаичные массивы выбирают геномную область (или даже весь геном) и делят ее на равные части. Такой участок называется плиточным путем. Среднее расстояние между каждой парой соседних фрагментов (измеренное от центра каждого фрагмента) дает разрешение мозаичного пути. Путь может быть перекрывающимся, сквозным или разнесенным.
Размер массива : первые микроматрицы, использованные для ChIP-on-Chip, содержали около 13000 пятнистых сегментов ДНК, представляющих все ORF и межгенные области генома дрожжей. В настоящее время Affymetrix предлагает полногеномные мозаичные дрожжевые массивы с разрешением 5 пар оснований (всего 3,2 миллиона зондов). Тайловые массивы генома человека также становятся все более мощными. Просто чтобы назвать один пример, Affymetrix предлагает набор из семи массивов с примерно 90 миллионами зондов, охватывающих полную неповторяющуюся часть человеческого генома с интервалом около 35 пар оснований. (Февраль 2007 г.) Помимо собственно микрочипа, для проведения экспериментов с чипом на кристалле необходимо другое аппаратное и программное обеспечение. Обычно микроматрицы одной компании не могут быть проанализированы аппаратным обеспечением другой компании. Следовательно, покупка массива требует также покупки соответствующего оборудования для рабочего процесса. Наиболее важными элементами являются, среди прочего, печи для гибридизации, сканеры чипов и пакеты программного обеспечения для последующего численного анализа исходных данных.
Рабочий процесс эксперимента ChIP-on-Chip
Начиная с биологического вопроса, эксперимент с чипом на чипе можно разделить на три основных этапа. Первый - это настройка и планирование эксперимента путем выбора соответствующей матрицы и типа зонда. Во-вторых, настоящий эксперимент проводится в мокрой лаборатории. Наконец, во время лабораторной части цикла собранные данные анализируются, чтобы либо ответить на первоначальный вопрос, либо привести к новым вопросам, чтобы цикл можно было начать заново.
Часть рабочего процесса с влажной лабораторией
На первом этапе интересующий белок (POI) перекрестно связывается с участком ДНК, с которым он связывается в среде in vitro . Обычно это достигается путем нежной фиксации формальдегидом , обратимой при нагревании.
Затем клетки лизируют и ДНК разрезают ультразвуком или с помощью микрококковой нуклеазы . В результате образуются двухцепочечные куски фрагментов ДНК, обычно длиной 1 т.п.н. или меньше. Те, которые были поперечно связаны с POI, образуют комплекс POI-ДНК.
На следующем этапе только эти комплексы отфильтровываются из набора фрагментов ДНК с использованием антитела, специфичного к POI. Антитела могут быть прикреплены к твердой поверхности, могут иметь магнитный шарик или какое-либо другое физическое свойство, которое позволяет разделить сшитые комплексы и несвязанные фрагменты. Эта процедура по сути представляет собой иммунопреципитацию (IP) белка. Это может быть сделано либо с использованием меченого белка с антителом против метки (например, FLAG , HA , c-myc), либо с помощью антитела к нативному белку.
Сшивание комплексов POI-ДНК обращается (обычно путем нагревания), и цепи ДНК очищаются. Для остальной части рабочего процесса точка интереса больше не нужна.
После стадии амплификации и денатурации одноцепочечные фрагменты ДНК метят флуоресцентной меткой, такой как Cy5 или Alexa 647.
Наконец, фрагменты выливаются на поверхность микроматрицы ДНК, на которую нанесены короткие одноцепочечные последовательности, покрывающие интересующую геномную часть. Всякий раз, когда меченый фрагмент «находит» комплементарный фрагмент в массиве, они гибридизуются и снова образуют двухцепочечный фрагмент ДНК.
Сухая лабораторная часть рабочего процесса
По прошествии достаточно большого периода времени, чтобы позволить гибридизацию, массив освещается флуоресцентным светом. Те зонды на матрице, которые гибридизируются с одним из меченых фрагментов, излучают световой сигнал, который фиксируется камерой. Это изображение содержит все необработанные данные для оставшейся части рабочего процесса.
Эти необработанные данные, закодированные как изображение в ложных цветах , необходимо преобразовать в числовые значения, прежде чем можно будет провести фактический анализ. Анализ и извлечение информации из необработанных данных часто остается самой сложной частью экспериментов с чипом на кристалле. Проблемы возникают на протяжении всей этой части рабочего процесса, начиная от начального считывания чипа и заканчивая подходящими методами вычитания фонового шума и, наконец, соответствующими алгоритмами, которые нормализуют данные и делают их доступными для последующего статистического анализа , который затем, мы надеемся, приведет к лучшее понимание биологического вопроса, на который пытается ответить эксперимент. Кроме того, из-за различных платформ массивов и отсутствия стандартизации между ними хранение и обмен данными представляет собой огромную проблему. Вообще говоря, анализ данных можно разделить на три основных этапа:
На первом этапе полученные сигналы флуоресценции от матрицы нормализуются с использованием сигналов управления, полученных от того же или второго чипа. Такие контрольные сигналы говорят о том, какие зонды на матрице были гибридизованы правильно, а какие неспецифично.
На втором этапе численные и статистические тесты применяются к контрольным данным и данным фракции IP, чтобы идентифицировать обогащенные POI области вдоль генома. Широко используются следующие три метода: средний процентильный ранг , ошибка одного массива и скользящее окно . Эти методы обычно различаются тем, как обрабатываются сигналы низкой интенсивности, насколько приемлемым является фоновый шум и какие особенности данных выделяются во время вычислений. В недавнем прошлом подход скользящего окна, по-видимому, был предпочтительным и часто описывался как наиболее эффективный.
На третьем этапе эти регионы анализируются дополнительно. Если, например, POI был фактором транскрипции, такие области представляли бы его сайты связывания. Последующий анализ может потребовать вывести нуклеотидные мотивы и другие паттерны, чтобы обеспечить функциональную аннотацию генома.
Сильные и слабые стороны
Используя мозаичные массивы , ChIP -on-chip обеспечивает высокое разрешение полногеномных карт. Эти карты могут определять сайты связывания многих ДНК-связывающих белков, таких как факторы транскрипции, а также модификации хроматина.
Хотя ChIP-on-Chip может быть мощным методом в области геномики, это очень дорого. Большинство опубликованных исследований с использованием ChIP-on-Chip повторяют свои эксперименты не менее трех раз, чтобы получить биологически значимые карты. Стоимость микрочипов ДНК часто является ограничивающим фактором при выборе лаборатории для проведения эксперимента с чипом на чипе. Еще одно ограничение - это достижимый размер фрагментов ДНК. Большинство протоколов «чип-на-чипе» используют ультразвуковую обработку как метод разделения ДНК на мелкие кусочки. Однако обработка ультразвуком ограничивается минимальным размером фрагмента 200 п.н. Для карт с более высоким разрешением это ограничение должно быть преодолено, чтобы получить более мелкие фрагменты, предпочтительно до разрешения одной нуклеосомы . Как упоминалось ранее, статистический анализ огромного количества данных, сгенерированных из массивов, является сложной задачей, и процедуры нормализации должны быть направлены на минимизацию артефактов и определение того, что действительно биологически значимо. До сих пор применение к геномам млекопитающих было серьезным ограничением, например, из-за значительного процента генома, занятого повторами. Однако по мере развития технологии ChIP-on-Chip должны стать доступными карты полного генома млекопитающих с высоким разрешением.
Антитела, используемые для ChIP -on-chip, могут быть важным ограничивающим фактором. ChIP -on-chip требует высокоспецифичных антител, которые должны распознавать его эпитоп в свободном растворе, а также в фиксированных условиях. Если доказано, что он успешно иммунопреципитирует сшитый хроматин , его называют « ChIP-grade ». Компании, которые предоставляют антитела класса ChIP, включают Abcam , Cell Signaling Technology , Santa Cruz и Upstate. Чтобы преодолеть проблему специфичности, интересующий белок можно слить с меткой, такой как FLAG или HA , которые распознаются антителами. Альтернативой ChIP-on-chip, не требующей антител, является DamID .
Также доступны антитела против специфической модификации гистона, такой как H3 триметил K4. Как упоминалось ранее, комбинация этих антител и ChIP-on-chip стала чрезвычайно мощной при определении полногеномного анализа паттернов модификаций гистонов и внесет огромный вклад в наше понимание гистонового кода и эпигенетики.
Исследование, демонстрирующее неспецифический характер ДНК-связывающих белков, было опубликовано в PLoS Biology. Это указывает на то, что альтернативное подтверждение функциональной релевантности является необходимым шагом в любом эксперименте с ChIP-чипом.
История
Первый эксперимент с чипом на чипе был проведен в 1999 году для анализа распределения когезина по хромосоме III почкующихся дрожжей . Хотя геном не был полностью представлен, протокол в этом исследовании остается таким же, как и в более поздних исследованиях. Затем метод ChIP-on-chip с использованием всех ORF генома (который, тем не менее, остается неполным, отсутствующими межгенными областями) был успешно применен в трех статьях, опубликованных в 2000 и 2001 годах. Авторы идентифицировали сайты связывания для отдельных факторов транскрипции в почковании. дрожжи Saccharomyces cerevisiae . В 2002 году группа Ричарда Янга определила положения 106 транскрипционных факторов по всему геному, используя систему мечения c-Myc в дрожжах. Первая демонстрация метода ChIp-on-Chip у млекопитающих показала, что выделение девяти фрагментов хроматина, содержащих слабый и сильный сайт связывания E2F, было проведено лабораторией Пегги Фарнхэм в сотрудничестве с лабораторией Майкла Чжана и опубликовано в 2001 году. Это исследование было проведено несколько месяцев спустя. в сотрудничестве между лабораторией Янга и лабораторией Брайана Динлахта, которая использовала технику ChIP-on-chip, чтобы впервые показать, что мишени E2F кодируют компоненты контрольной точки повреждения ДНК и путей восстановления, а также факторы, участвующие в сборке хроматина / конденсация, сегрегация хромосом и контрольная точка митотического веретена. Другие применения ChIP-on-chip включают репликацию ДНК , рекомбинацию и структуру хроматина. С тех пор ChIP-on-Chip стал мощным инструментом для определения полногеномных карт модификаций гистонов и многих других факторов транскрипции. ChIP-on-chip в системах млекопитающих затруднено из-за больших и повторяющихся геномов. Таким образом, многие исследования на клетках млекопитающих были сосредоточены на избранных промоторных областях, которые, как предполагается, связывают факторы транскрипции, и не анализировали весь геном. Тем не менее, массивы целых геномов млекопитающих недавно стали коммерчески доступны от таких компаний, как Nimblegen. В будущем, по мере того, как массивы ChIP-on-Chip будут становиться все более и более совершенными, карты полного генома с высоким разрешением ДНК-связывающих белков и компонентов хроматина для млекопитающих будут анализироваться более подробно.
Альтернативы
Представленная в 2007 году технология ChIP-секвенирования (ChIP-seq) - это технология, использующая иммунопреципитацию хроматина для перекрестного связывания представляющих интерес белков с ДНК, но затем вместо использования микромассивов она использует более точный и высокопроизводительный метод секвенирования для локализации точки взаимодействия.
DamID - альтернативный метод, не требующий антител.
ChIP-exo использует обработку экзонуклеазой для достижения разрешения до одной пары оснований.
Секвенирование CUT & RUN использует распознавание антител с целевым ферментативным расщеплением для устранения некоторых технических ограничений ChIP.
использованная литература
дальнейшее чтение
- Джонсон, МЫ; Li, W .; Мейер, Калифорния; Gottardo, R .; Кэрролл, JS; Brown, M .; Лю, XS (2006). «Модельный анализ тайлинг-массивов для ChIP-чипов» . Труды Национальной академии наук . 103 (33): 12457–12462. Bibcode : 2006PNAS..10312457J . DOI : 10.1073 / pnas.0601180103 . ISSN 0027-8424 . PMC 1567901 . PMID 16895995 .
- Бенукраф, Туати ; Коши, Пьер; Фенуй, Ромен; Жанниар, Адриан; Кох, Фредерик; Егер, Себастьян; Тиффри, Денис; Имбер, Жан; Андрау, Жан-Кристоф; Спикулия, Сальваторе; Феррье, Пьер (2009). «CoCAS: набор для анализа чипов на кристалле» . Биоинформатика . 25 (7): 954–955. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btp075 . ISSN 1460-2059 . PMC 2660873 . PMID 19193731 .
внешние ссылки
- http://www.genome.gov/10005107 ENCODE project
- Информация о пакете Chip-on-Chip (CoC) от Amkor Technology