История полимеразной цепной реакции - History of polymerase chain reaction

Основная статья: Полимеразная цепная реакция
(В этой статье предполагается, что вы знакомы с терминами и компонентами, используемыми в процессе ПЦР.)
Структура ДНК.
Репликация ДНК.
ДНК-полимераза I (PDB).
Молекулярный механизм ПЦР.
Полоска из восьми пробирок для ПЦР.

История полимеразной цепной реакции (ПЦР) различно было описано как классический «Эврика!» момент, или как пример совместной работы разрозненных исследователей. Ниже приводится список событий до, во время и после его развития:

Прелюдия

  • 25 апреля 1953 года Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали «радикально другую структуру» ДНК , тем самым положив начало области молекулярной генетики . Их структурная модель включала две нити ДНК с комплементарными парами оснований , идущую в противоположных направлениях в виде двойной спирали. Они завершили свой отчет, заявив, что «мы не ускользнули от нашего внимания, что конкретное сочетание, которое мы постулировали, сразу же предполагает возможный механизм копирования генетического материала». За это понимание они были удостоены Нобелевской премии в 1962 году .
  • Начиная с середины 1950-х годов , Корнберг начал изучать механизм репликации ДНК . К 1957 году он идентифицировал первую ДНК-полимеразу . Фермент был ограничен, создавая ДНК только в одном направлении и требуя существующего праймера для инициации копирования цепи матрицы. В целом, процесс репликации ДНК удивительно сложен, требует отдельных белков открыть спираль ДНК, чтобы держать его открытым, чтобы создать праймеры , чтобы синтезировать новую ДНК, чтобы удалить праймеры и связать части все вместе. Корнберг был удостоен Нобелевской премии в 1959 году .
  • В начале 1960-х Х. Гобинд Хорана добился значительных успехов в выяснении генетического кода . Впоследствии он инициировал большой проект по полному синтезу функционального гена человека . Чтобы достичь этого, Хорана разработал многие методы, необходимые для создания и использования синтетических ДНК- олигонуклеотидов . Последовательно-специфичные олигонуклеотиды использовались как в качестве строительных блоков для гена, так и в качестве праймеров и матриц для ДНК-полимеразы. В 1968 году Хорана был удостоен Нобелевской премии за работу над Генетическим кодом.
  • В 1969 году Томас Д. Брок сообщил о выделении нового вида бактерий из горячего источника в Йеллоустонском национальном парке . Thermus aquaticus (Taq) стал стандартным источником ферментов, способных выдерживать более высокие температуры, чем у E. Coli .
  • В 1970 году Кленов сообщил о модифицированной версии ДНК-полимеразы I из E. coli . Обработка протеазой устраняла «прямую» нуклеазную активность этого фермента. Таким образом, общая активность полученного фрагмента Кленова смещена в сторону синтеза ДНК, а не ее деградации.
  • К 1971 году исследователи проекта Хораны, обеспокоенные выходом ДНК, начали рассматривать «репаративный синтез» - искусственную систему праймеров и матриц, которая позволяет ДНК-полимеразе копировать сегменты синтезируемого ими гена. Хотя процесс повторения ДНК-полимеразы аналогичен ПЦР, обычно описываемый процесс использует только один комплекс праймер-матрица и, следовательно, не приводит к экспоненциальной амплификации, наблюдаемой в ПЦР.
  • Приблизительно в 1971 году Кьелл Клеппе , исследователь лаборатории Хораны, представил процесс, очень похожий на ПЦР. В конце статьи о более ранней технике он описал, как двухпраймерная система может привести к репликации определенного сегмента ДНК:
«можно было бы надеяться получить две структуры, каждая из которых содержит полную длину цепи матрицы, должным образом образовав комплекс с праймером. ДНК-полимераза будет добавлена ​​для завершения процесса репликации репарации. В результате должны получиться две молекулы исходного дуплекса. повторять, добавляя каждый раз новую дозу фермента ».
Никаких результатов там не показано, и упоминание неопубликованных экспериментов в другой статье может (или не может) относиться к системе репликации с двумя праймерами. (Эти ранние предшественники ПЦР были тщательно изучены в патентном иске и обсуждаются в главах Маллиса в «Полимеразной цепной реакции» (1994).)
  • В том же 1971 году в Беркли, штат Калифорния , Рональдом Кейпом, Питером Фарли и Дональдом Глейзером была основана Cetus Corporation . Первоначально компания провела скрининг на наличие микроорганизмов, способных производить компоненты, используемые при производстве продуктов питания, химикатов, вакцин или фармацевтических препаратов. Переехав в соседний Эмеривилл , они начали проекты, связанные с новой индустрией биотехнологий , в первую очередь клонированием и экспрессией человеческих генов, а также разработкой диагностических тестов на генетические мутации.
  • В 1976 ДНК - полимераза была выделена из Т. адиайсиза . Было обнаружено, что он сохраняет свою активность при температурах выше 75 ° C.
  • В 1977 году Фредерик Сэнджер сообщил о методе определения последовательности ДНК. В методике использовались олигонуклеотидный праймер , ДНК-полимераза и модифицированные предшественники нуклеотидов, которые блокируют дальнейшее удлинение праймера в зависимости от последовательности. Для этого нововведения он был удостоен Нобелевской премии в 1980 году .

К 1980 г. научному сообществу были известны все компоненты, необходимые для проведения ПЦР-амплификации. Использование ДНК-полимеразы для удлинения олигонуклеотидных праймеров было обычной процедурой при секвенировании ДНК и производстве кДНК для клонирования и экспрессии . Использование ДНК-полимеразы для ник-трансляции было наиболее распространенным методом метки ДНК-зондов для саузерн-блоттинга .

Тема

  • В 1979 году корпорация Cetus наняла Кэри Маллис для синтеза олигонуклеотидов для различных исследовательских и опытно-конструкторских проектов всей компании. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве зондов для скрининга клонированных генов, в качестве праймеров для секвенирования ДНК и синтеза кДНК, а также в качестве строительных блоков для конструирования генов. Первоначально синтезируя эти олигонуклеотиды вручную, Муллис позже оценил ранние прототипы автоматических синтезаторов.
  • К маю 1983 года Маллис синтезировал олигонуклеотидные зонды для проекта Cetus по анализу мутации серповидно-клеточной анемии . Узнав о проблемах с их работой, Маллис предложил альтернативную технику, основанную на методе секвенирования ДНК Сэнгера . Понимая, насколько сложно сделать метод Сэнгера специфичным для одного места в геноме, Муллис изменил идею, добавив второй праймер к противоположной цепи. Повторные применения полимеразы могут привести к цепной реакции репликации для определенного сегмента генома - ПЦР.
  • Позже, в 1983 году, Маллис начал проверять свою идею. Его первый эксперимент не включал термоциклирование - он надеялся, что полимераза сможет выполнять непрерывную репликацию самостоятельно. Более поздние эксперименты в том же году включали повторные термоциклы и нацелены на небольшие сегменты клонированного гена. Муллис считал эти эксперименты успешными, но не смог убедить других исследователей.
  • В июне 1984 года Cetus провел свое ежегодное собрание в Монтерее, Калифорния . Его ученые и консультанты представили свои результаты и рассмотрели будущие проекты. Муллис представил плакат о производстве олигонуклеотидов в своей лаборатории и представил некоторые результаты своих экспериментов с ПЦР. Только Джошуа Ледерберг , консультант Cetus, проявил интерес. Позже на встрече Муллис был вовлечен в физическую ссору с другим исследователем Cetus из-за спора, не связанного с PCR. Другой ученый покинул компанию, и Муллис был снят с должности главы лаборатории синтеза олигонуклеотидов.

Разработка

  • В сентябре 1984 года Том Уайт, вице- президент Cetus по исследованиям (и его близкий друг), убедил Маллиса передать его идею группе, разрабатывающей анализ генетических мутаций. Вместе они потратили следующие месяцы на разработку экспериментов, которые могли бы убедительно показать, что ПЦР работает с геномной ДНК. К сожалению, ожидаемый продукт амплификации не был виден при электрофорезе в агарозном геле , что привело к путанице в отношении того, имеет ли реакция какую-либо специфичность к целевой области.
  • В ноябре 1984 г. продукты амплификации были проанализированы методом Саузерн-блоттинга , который четко продемонстрировал увеличение количества ожидаемого продукта ДНК размером 110 п.н. Получив первый видимый сигнал, исследователи приступили к оптимизации процесса. Позже амплифицированные продукты были клонированы и секвенированы, что показало, что только небольшая часть амплифицированной ДНК является желаемой мишенью и что используемый затем фрагмент Кленова лишь изредка включает неправильные нуклеотиды во время репликации.

Экспозиция

  • После обычной промышленной практике Маллис применяется для патента , покрывающей основную идею ПЦР и многих потенциальных приложений, и было предложено в ВОМ включать больше результатов. 28 марта 1985 года группа разработчиков Маллиса подала заявку на анализ мутации серповидно-клеточной анемии с помощью ПЦР и ограничения олигомера . После модификации, оба патента были утверждены 28 июля 1987 года .
  • В весной 1985 года группа разработчиков стали применять метод ПЦР для других целей. Праймеры и зонды были сконструированы для вариабельного сегмента гена человеческого лейкоцитарного антигена DQα . Эта реакция была намного более специфичной, чем реакция для мишени β-гемоглобина - ожидаемый продукт ПЦР непосредственно виден при электрофорезе в агарозном геле . Также были клонированы и секвенированы продукты амплификации из различных источников, первое определение новых аллелей с помощью ПЦР. В то же время оригинальный метод анализа рестрикции олигомеров был заменен более общим методом аллель-специфических олигонуклеотидов .
  • Также в начале 1985 года группа начала использовать термостабильную ДНК-полимеразу ( фермент, использованный в исходной реакции, разрушается на каждой стадии нагревания). В то время были описаны только два, от Taq и Bst . Отчет по Taq-полимеразе был более подробным, поэтому он был выбран для тестирования. Позже было обнаружено, что полимераза Bst не подходит для ПЦР. Тем летом Муллис попытался выделить фермент, и группа за пределами Кита была нанята, чтобы сделать это, но безуспешно. В осенью 1985 Susanne Штоффеля и Дэвид Гельфанда на Cetus удастся сделать полимеразу, и он сразу же был найден Рэнди Сайки для поддержки процесса ПЦР.
  • После подачи патентов была продолжена работа по сообщению ПЦР широкому научному сообществу. Абстрактный для Американского общества генетики человека встречи в Солт - Лейк - Сити был представлен в апреле 1985 года , и был сделан первый анонс ПЦР там Сайки в октябре . Были запланированы две публикации - документ с «идеей» от Маллиса и документ о «применении» от всей группы разработчиков. Муллис представил свою рукопись в журнал Nature , который отклонил ее из-за отсутствия результатов. Другой документ, в основном , описывающее или анализа анализа, был представлен в науке по 20 сентября 1985 года и был принят в ноябре. После отклонения отчета Маллиса в декабре подробности процесса PCR были поспешно добавлены во второй документ, который появился 20 декабря 1985 года .
  • В мае 1986 года Маллис представил PCR на симпозиуме в Колд-Спринг-Харбор и намного позже опубликовал модифицированную версию своей оригинальной рукописи «идеи». Первый отчет не-Cetus с использованием ПЦР был представлен 5 сентября 1986 года , что указывает на то, как быстро другие лаборатории начали внедрять этот метод. Группа разработки Cetus опубликовали подробный анализ последовательности продуктов ПЦР на 8 сентября 1986 года , а также их использование ASO зондов на 13 ноября 1986 года .
  • Об использовании Taq-полимеразы в ПЦР было объявлено Генри Эрлихом на встрече в Берлине 20 сентября 1986 г. , представлено для публикации в октябре 1987 г. и опубликовано в начале следующего года ». Патент на ПЦР с Taq - полимеразы , поданной 17 июня 1987 года , и был выпущен 23 октября 1990 года .

Вариация

  • В декабре 1985 г. было создано совместное предприятие Cetus и Perkin-Elmer для разработки приборов и реагентов для ПЦР. Сложные термоциклеры были сконструированы для выполнения амплификаций на основе Кленова, но никогда не поступали в продажу. Были разработаны более простые машины для ПЦР на основе Taq, и 19 ноября 1987 г. в пресс-релизе сообщается о коммерческой доступности «термоциклера PCR-1000» и «ДНК-полимеразы AmpliTaq».
  • В Весной 1985 года Джон Sninsky в Cetus начал использовать ПЦР для трудной задачи измерения количества ВИЧ , циркулирующих в крови. Жизнеспособный тест был объявлен 11 апреля 1986 года и опубликован в мае 1987 года . Затем донорскую кровь можно было проверять на наличие вируса и непосредственно контролировать действие противовирусных препаратов.
  • В 1985 году Норм Арнхейм, также входивший в группу разработчиков, завершил свой творческий отпуск в Cetus и занял академическую должность в USC . Он начал исследовать использование ПЦР для амплификации образцов, содержащих только одну копию целевой последовательности. К 1989 году его лаборатория разработала мультиплексную ПЦР на отдельных сперматозоидах для прямого анализа продуктов мейотической рекомбинации. Эти однокопийные амплификации, которые впервые были проведены во время характеристики полимеразы Taq, стали жизненно важными для изучения древней ДНК , а также генетического типирования предварительно имплантированных эмбрионов.
  • В 1986 году Эдвард Блейк, судебно-медицинский эксперт, работавший в здании Cetus, сотрудничал с Генри Эрлихом, исследователем из Cetus, чтобы применить метод PCR к анализу улик. Панель образцов ДНК из старых случаев была собрана, закодирована и проанализирована Сайки вслепую с использованием анализа HLA DQα. Когда код был взломан, все улики и преступники совпали. Группа Блейка и Эрлиха практически сразу применила эту технику в деле «Пенсильвания против Пестиникас», первом применении PCR в уголовном деле. Этот тест DQα разработан Cetus как один из их наборов «Ampli-Type» и стал частью ранних протоколов для проверки судебно-медицинских доказательств, таких как дело об убийстве О. Дж. Симпсона .
  • К 1989 году Алек Джеффрис , который ранее разработал и применил первые тесты ДНК-отпечатков пальцев , использовал ПЦР для повышения своей чувствительности. При дальнейшей модификации амплификация высокополиморфных локусов VNTR стала стандартным протоколом для национальных баз данных ДНК, таких как CODIS .
  • В 1987 году Руссу Хигучи удалось амплифицировать ДНК человеческого волоса. Эта работа расширилась, чтобы разработать методы амплификации ДНК из сильно деградированных образцов, например из древней ДНК, и из судебно-медицинских доказательств.

Coda

  • 22 декабря 1989 г. журнал Science наградил Taq Polymerase (и PCR) своей первой «Молекулой года». Статья «Taq PCR» на несколько лет стала самой цитируемой публикацией в области биологии.
  • После публикации первого документа PCR правительство Соединенных Штатов направило суровое письмо Рэнди Сайки, в котором упрекнул его за публикацию отчета о «цепных реакциях» без необходимого предварительного рассмотрения и одобрения Министерством энергетики США . Цетус ответил, объяснив разницу между ПЦР и атомной бомбой .
  • 23 июля 1991 года Cetus объявила о своей продаже соседней биотехнологической компании Chiron . В рамках продажи права на патенты PCR были проданы за 300 миллионов долларов США Hoffman-La Roche (который в 1989 году купил ограниченные права на PCR). Многие исследователи Cetus PCR перешли в дочернюю компанию Roche Molecular Systems .
  • 13 октября 1993 года Кэри Муллис , покинувшая Cetus в 1986 году , была удостоена Нобелевской премии по химии . Утром в день его благодарственной речи он был чуть не арестован шведскими властями за «ненадлежащее использование лазерной указки».

Рекомендации