Неконкурентное торможение - Non-competitive inhibition
Неконкурентное ингибирование представляет собой тип ингибирования фермента, при котором ингибитор снижает активность фермента и одинаково хорошо связывается с ферментом, независимо от того, связал он уже субстрат или нет.
Ингибитор может связываться с ферментом независимо от того, был ли уже связан субстрат, но если он имеет более высокое сродство к связыванию фермента в том или ином состоянии, он называется смешанным ингибитором .
История
За годы работы врачом Михаэлис и его друг (Питер Рона) построили небольшую лабораторию в больнице, и в течение пяти лет Михаэлис успешно публиковался более 100 раз. Во время своих исследований в больнице он первым увидел различные типы торможения; конкретно с использованием фруктозы и глюкозы в качестве ингибиторов активности мальтазы . Мальтаза расщепляет мальтозу на две единицы глюкозы. Результаты этого эксперимента позволили выявить расхождение между неконкурентным и конкурентным ингибированием . Неконкурентное торможение влияет на значение k cat (но не на K m ) на любом заданном графике; этот ингибитор связывается с сайтом, специфичным для определенной молекулы. Михаэлис определил, что при связывании ингибитора фермент будет инактивирован.
Как и многие другие ученые своего времени, Михаэлис и Мод Ментен работал над реакцией , которая была использована для изменения конформации сахарозы и сделать его лизиса на два продукта - фруктозу и глюкозу. Фермент, участвующий в этой реакции, называется инвертаза , и это фермент, кинетика которого была подтверждена Михаэлисом и Ментеном и является революционным для кинетики других ферментов. Выражая скорость изучаемой реакции, они вывели уравнение, описывающее скорость таким образом, чтобы предположить, что она в основном зависит от концентрации фермента, а также от присутствия субстрата, но только в определенной степени.
Адриан Браун и Виктор Анри заложили основу для открытий в кинетике ферментов, которыми известны Михаэлис и Ментен. Браун теоретически представил механизм, принятый в настоящее время для кинетики ферментов, но не имел количественных данных, чтобы сделать это заявление. Виктор Анри внес значительный вклад в кинетику ферментов во время своей докторской диссертации, однако он не заметил важности концентрации ионов водорода и мутаротации глюкозы. Целью диссертации Генри было сравнить его знания о реакциях, катализируемых ферментами, с признанными законами физической химии. Генри считается первым, кто написал уравнение, которое теперь известно как уравнение Михаэлиса-Ментен. Используя глюкозу и фруктозу в каталитических реакциях, контролируемых мальтазой и инвертазой, Леонор Михаэлис был первым ученым, который различил различные типы ингибирования с помощью шкалы pH, которой не было во времена Генри.
В частности, во время своей работы по описанию скорости этой реакции они также протестировали и экстраполировали идею другого ученого, Виктора Анри , что фермент, который они использовали, имел некоторое сродство к обоим продуктам этой реакции - фруктозе и глюкозе. Используя методы Анри, Михаэлис и Ментен почти усовершенствовали эту концепцию метода начальной скорости для стационарных экспериментов. Они изучали ингибирование, когда обнаружили, что неконкурентное (смешанное) ингибирование характеризуется своим влиянием на k cat (скорость катализатора), в то время как конкурентное характеризуется своим влиянием на скорость (V). В экспериментах Михаэлиса и Ментен они в значительной степени сосредоточились на влиянии инвертазы на pH с использованием ионов водорода. Инвертаза - это фермент, обнаруженный во внеклеточных дрожжах и катализируемый реакциями путем гидролиза или превращения сахарозы (смеси сахарозы и фруктозы) в « инвертный сахар ». Основная причина использования инвертазы заключалась в том, что ее можно было легко проанализировать, а эксперименты можно было проводить быстрее. Сахароза вращается в поляриметре как правовращающий-D, тогда как инвертный сахар является левовращающим-L . Это сделало отслеживание инверсии сахара относительно простым. Они также обнаружили, что α-D-глюкоза высвобождается в реакциях, катализируемых инвертазой, которая очень нестабильна и спонтанно превращается в β-D-глюкозу . Хотя они оба находятся в правовращающей форме, именно здесь они отметили, что глюкоза может изменяться спонтанно, также известное как мутаротация. Неспособность принять это во внимание была одной из основных причин, по которой эксперименты Генри не оправдались. Используя инвертазу для катализа инверсии сахарозы, они смогли увидеть, насколько быстро реагирует фермент, с помощью поляриметрии; поэтому было обнаружено, что неконкурентное ингибирование происходит в реакции, в которой сахароза инвертировалась с помощью инвертазы.
Терминология
Важно отметить, что хотя все неконкурентные ингибиторы связывают фермент в аллостерических сайтах (то есть в местах, отличных от его активного сайта ), не все ингибиторы, которые связываются в аллостерических сайтах, являются неконкурентными ингибиторами. Фактически, аллостерические ингибиторы могут действовать как конкурентные , неконкурентные или неконкурентные ингибиторы.
Многие источники продолжают объединять эти два термина или давать определение аллостерического торможения как определение неконкурентного торможения.
Механизм
Неконкурентное ингибирование моделирует систему, в которой ингибитор и субстрат могут быть связаны с ферментом в любой момент времени. Когда и субстрат, и ингибитор связаны, комплекс фермент-субстрат-ингибитор не может образовывать продукт и может быть преобразован только обратно в комплекс фермент-субстрат или комплекс фермент-ингибитор. Неконкурентное ингибирование отличается от общего смешанного ингибирования тем, что ингибитор имеет одинаковое сродство к ферменту и комплексу фермент-субстрат.
Например, в катализируемых ферментами реакциях гликолиза накопление фосфоенола катализируется пируваткиназой в пируват . Аланин - это аминокислота, которая синтезируется из пирувата, также ингибирует фермент пируваткиназу во время гликолиза. Аланин - неконкурентный ингибитор, поэтому он связывается от активного центра с субстратом, чтобы он оставался конечным продуктом.
Другой пример неконкурентного ингибирования - гексокиназа, ингибирующая глюкозо-6-фосфат в головном мозге. Углероды 2 и 4 на глюкозо-6-фосфате содержат гидроксильные группы, которые присоединяются вместе с фосфатом на углероде 6 к комплексу фермент-ингибитор. Субстрат и фермент различаются по групповым комбинациям, к которым присоединяется ингибитор. Способность глюкозо-6-фосфата связываться одновременно в разных местах делает его неконкурентным ингибитором.
Наиболее распространенный механизм неконкурентного ингибирования включает обратимое связывание ингибитора с аллостерическим сайтом , но ингибитор может действовать другими способами, включая прямое связывание с активным сайтом. Оно отличается от конкурентного ингибирования тем, что связывание ингибитора не препятствует связыванию субстрата и наоборот, а просто предотвращает образование продукта в течение ограниченного времени.
Этот тип ингибирования уменьшает максимальную скорость в виде химической реакции без изменения кажущегося связывания аффинности в катализаторе для подложки (K м приложения - см кинетики Михаэлиса-Ментен ). Когда добавляется неконкурентный ингибитор, Vmax изменяется, в то время как Km остается неизменным. Согласно графику Лайнуивера-Берка, Vmax уменьшается во время добавления неконкурентного ингибитора, что показано на графике изменением наклона кривой и пересечения по оси Y при добавлении неконкурентного ингибитора.
Основное различие между конкурентным и неконкурентным является то, что конкурентное ингибирование влияет на способность субстрата связываться путем связывания ингибитора вместо субстрата, что снижает сродство фермента к субстрату. При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с аллостерическим сайтом и предотвращает выполнение химической реакции фермент-субстратным комплексом. Это не влияет на Km (сродство) фермента (к субстрату). Неконкурентное ингибирование отличается от неконкурентного ингибирования тем, что оно все еще позволяет субстрату связываться с комплексом фермент-ингибитор и образовывать комплекс фермент-субстрат-ингибитор, это неверно при неконкурентном ингибировании, оно предотвращает связывание субстрата с ферментом. ингибитор через конформационные изменения при аллостерическом связывании.
Уравнение
В присутствии неконкурентного ингибитора кажущееся сродство к ферменту эквивалентно фактическому сродству. С точки зрения кинетики Михаэлиса-Ментен , K m app = K m . Это можно рассматривать как следствие принципа Ле Шателье, поскольку ингибитор в равной степени связывается как с ферментом, так и с комплексом фермент-субстрат, так что равновесие сохраняется. Однако, поскольку некоторые ферменты всегда препятствуют превращению субстрата в продукт, эффективная концентрация фермента снижается.
Математически,
![V _ {{max}} ^ {{app}} = {\ frac {V _ {{max}}} {1 + {\ frac {[I]} {K_ {I}}}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/1b945d1d3deff510520bdb20f9865068d4d12c4d)
![{кажущийся \ [E] _ {0}} = {\ frac {[E] _ {0}} {1 + {\ frac {[I]} {K_ {I}}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/b5dc3a4908e8409124b361d5e495f6d2f54f636e)
Пример: неконкурентные ингибиторы фермента CYP2C9.
Неконкурентные ингибиторы фермента CYP2C9 включают нифедипин , транилципромин , фенэтилизотиоцианат и 6-гидроксифлавон. Компьютерное моделирование стыковки и замененные сконструированные мутанты показывают, что неконкурентный сайт связывания 6-гидроксифлавона является зарегистрированным сайтом аллостерического связывания фермента CYP2C9 .