Фазово-контрастная микроскопия - Phase-contrast microscopy

Фазово-контрастный микроскоп

Фазово-контрастный микроскоп
Использует	Микроскопическое наблюдение неокрашенного биологического материала
Изобретатель	Фриц Зернике
Производитель	Leica , Zeiss , Nikon , Olympus и другие
Модель	кгт
Похожие материалы	Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия , модуляционно-контрастная микроскопия Хоффмана , количественная фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия (ФКМ) - это метод оптической микроскопии , который преобразует фазовые сдвиги света, проходящего через прозрачный образец, в изменения яркости изображения. Сами фазовые сдвиги невидимы, но становятся видимыми, когда отображаются как изменения яркости.

Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума , взаимодействие со средой вызывает изменение амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, которое часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов. Фотографическое оборудование и человеческий глаз чувствительны только к колебаниям амплитуды. Таким образом, без специальных мер фазовые переходы невидимы. Тем не менее, фазовые изменения часто несут важную информацию.

Те же клетки, полученные с помощью традиционной светлопольной микроскопии (слева) и фазово-контрастной микроскопии (справа)

Фазово-контрастная микроскопия особенно важна в биологии. Он показывает множество клеточных структур, которые невидимы в светопольный микроскоп , как показано на рисунке. Эти структуры были сделаны видимыми для более ранних микроскопистов путем окрашивания , но это потребовало дополнительной подготовки и гибели клеток. Фазово-контрастный микроскоп позволил биологам изучать живые клетки и то, как они размножаются посредством деления клеток . Это один из немногих доступных методов количественной оценки клеточной структуры и компонентов, который не использует флуоресценцию . После изобретения в начале 1930-х годов фазово-контрастная микроскопия оказалась таким достижением в микроскопии, что ее изобретатель Фриц Зернике был удостоен Нобелевской премии по физике в 1953 году.

Принцип работы

Воспроизвести медиа

Принцип работы темнопольного и фазово-контрастного микроскопов

Основной принцип, позволяющий сделать фазовые изменения видимыми в фазово-контрастной микроскопии, состоит в том, чтобы отделить освещающий (фоновый) свет от света, рассеянного образцом (который составляет детали переднего плана), и по-разному управлять ими.

Кольцевой световой индикатор (зеленый), проходящий через кольцевое пространство конденсатора, фокусируется конденсатором на образец. Часть освещающего света рассеивается образцом (желтый). Оставшийся свет не зависит от образца и образует фоновый свет (красный). При наблюдении за неокрашенным биологическим образцом рассеянный свет является слабым и обычно сдвинут по фазе на -90 ° (как из-за типичной толщины образцов, так и из-за разницы показателей преломления между биологической тканью и окружающей средой) относительно фонового света. Это приводит к тому, что передний план (синий вектор) и фон (красный вектор) имеют почти одинаковую интенсивность, что приводит к низкому контрасту изображения .

В фазово-контрастном микроскопе контраст изображения увеличивается двумя способами: за счет создания конструктивной интерференции между рассеянными и фоновыми световыми лучами в областях поля зрения, в которых находится образец, и за счет уменьшения количества фонового света, который достигает плоскости изображения. . Во-первых, фоновый свет сдвигается по фазе на -90 °, пропуская его через кольцо фазового сдвига, что устраняет разность фаз между фоном и рассеянными световыми лучами.

Когда свет затем фокусируется на плоскости изображения (где размещается камера или окуляр), этот фазовый сдвиг заставляет фоновые и рассеянные световые лучи, исходящие из областей поля зрения, содержащих образец (т. Е. Передний план), конструктивно мешать , что приводит к увеличению яркости этих областей по сравнению с областями, не содержащими образец. Наконец, фон затемняется на ~ 70-90% серым кольцом фильтра ; этот метод максимизирует количество рассеянного света, генерируемого освещающим (т. е. фоновым) светом, минимизируя при этом количество освещающего света, достигающего плоскости изображения. Часть рассеянного света, который освещает всю поверхность фильтра, будет сдвинут по фазе и затемнен кольцами, но в гораздо меньшей степени, чем фоновый свет, который освещает только кольца фазового сдвига и серого фильтра.

Выше описан отрицательный фазовый контраст . В положительной форме фоновый свет сдвинут по фазе на + 90 °. Таким образом, фоновый свет будет сдвинут по фазе на 180 ° относительно рассеянного света. Затем рассеянный свет будет вычтен из фонового света, чтобы сформировать изображение с более темным передним планом и более светлым фоном, как показано на первом рисунке.

Связанные методы

Клетки S. cerevisiae, полученные с помощью ДИК-микроскопии

Количественная фазово-контрастной микроскопии изображение клеток в культуре. Высота и цвет точки изображения соответствуют оптической толщине, которая зависит только от толщины объекта и относительного показателя преломления . Таким образом, объем объекта можно определить, если известна разница в показателе преломления между объектом и окружающей средой.

Успех фазово-контрастного микроскопа привел к появлению ряда последующих методов фазовой визуализации . В 1952 году Жорж Номарски запатентовал то, что сегодня известно как микроскопия с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) . Он увеличивает контраст за счет создания искусственных теней, как будто объект освещен сбоку. Но ДИК-микроскопия не подходит, когда объект или его контейнер изменяют поляризацию. С ростом использования поляризационных пластиковых контейнеров в клеточной биологии, ДВС-микроскопия все чаще заменяется микроскопией с модуляционным контрастом Хоффмана , изобретенной Робертом Хоффманом в 1975 году.

Традиционные методы фазового контраста увеличивают контраст оптически, смешивая информацию о яркости и фазе в одном изображении. С момента появления цифровой камеры в середине 1990-х годов было разработано несколько новых методов цифровой фазовой визуализации, известных под общим названием количественная фазово-контрастная микроскопия . Эти методы создают в цифровом виде два отдельных изображения, обычное изображение в светлом поле и так называемое изображение с фазовым сдвигом . В каждой точке изображения изображение с фазовым сдвигом отображает количественный фазовый сдвиг, индуцированный объектом, который пропорционален оптической толщине объекта.

Смотрите также

• Визуализация живых клеток
• Фазово-контрастное изображение
• Фазово-контрастное рентгеновское изображение

использованная литература

внешние ссылки

• Праймер для оптической микроскопии - фазово-контрастная микроскопия , Университет штата Флорида
• Фазово-контрастные и темнопольные микроскопы (Université Paris Sud)