ШАПКА средняя - HAT medium

Отбор HAT, изображенный мутантом тимидинкиназы плазмоцитомы, слитым со смертной B-клеткой селезенки .

Среда НАТА ( гипоксантин - аминоптерин - тимидин среды ) является селективной средой для культивирования клеток млекопитающих, который основан на комбинации аминоптерина , препарат , который действует как мощный фолата ингибитор метаболизма путем ингибирования дигидрофолатредуктазы , с гипоксантин (а пуриновая производной) и тимидина (а дезокси нуклеозид ) , которые являются промежуточными продуктами в синтезе ДНК . Хитрость в том, что аминоптерин блокирует синтез ДНК de novo , который абсолютно необходим для продолжения деления клеток , но гипоксантин и тимидин обеспечивают клетки сырьем, чтобы избежать блокировки («путь спасения»), при условии, что в них есть нужные ферменты. , что означает наличие функционирующих копий кодирующих их генов .

Фермент дигидрофолатредуктаза , который производит тетрагидрофолат (ТГФ) путем восстановления дигидрофолата, специфически блокируется аминоптерином. THF, действуя в ассоциации со специфическими белками , может получать единичные углеродные единицы, которые затем переносятся на определенные цели.

Одной из важных мишеней для клеточного воспроизводства является тимидилатсинтаза , которая создает тимидинмонофосфат (ТМФ) из дезоксиуридинмонофосфата (dUMP). Путем дополнительных реакций фосфорилирования TMP можно использовать для получения тимидинтрифосфата (TTP), одного из четырех предшественников нуклеотидов, которые используются ДНК-полимеразами для создания ДНК . Без ТГФ, необходимого для преобразования dUMP, не может быть ТТФ, и синтез ДНК не может продолжаться, если ТМФ не может быть произведен из другого источника. Альтернативным источником является тимидин, присутствующий в среде HAT, который может абсорбироваться клетками и фосфорилироваться тимидинкиназой (TK) в TMP.

Синтез IMP (предшественник GMP и GTP, а также AMP и ATP) также требует THF, и его также можно обойти. В этом случае гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT) реагирует на гипоксантин, абсорбированный из среды, с PRPP , высвобождая пирофосфат , с образованием IMP путем спасения.

Следовательно, использование среды HAT для культивирования клеток является формой искусственного отбора клеток, содержащих рабочие TK и HGPRT. Многие полезные усовершенствования схемы стали возможны благодаря ядам, которые убивают клетки, но к которым они невосприимчивы, если у них отсутствует один из этих генов. Таким образом, клетка, лишенная TK, устойчива к бромдезоксиуридину (BrdU), а клетка, лишенная HGPRT, устойчива к 6-тиогуанину (6-TG) и 8-азагуанину . Таким образом, селекция с одним из последних двух препаратов с последующей средой HAT даст ревертантные колонии.

Приложения

Среда HAT используется для получения моноклональных антител . Этот процесс называется гибридомной технологией . Лабораторные животные (например, мыши) сначала подвергаются воздействию антигена, против которого мы хотим выделить антитело . После выделения спленоцитов от млекопитающего B-клетки сливаются с HGPRT-отрицательными иммортализованными миеломными клетками с использованием полиэтиленгликоля или вируса Сендай . Слитые клетки инкубируют в среде HAT . Аминоптерин в среде блокирует путь de novo . Следовательно, неслитые миеломные клетки умирают, так как они не могут продуцировать нуклеотиды путем de novo или спасательного пути. Неслитые В-клетки умирают, поскольку имеют короткую продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клетки и миеломы. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство миеломных клеток). Затем инкубированную среду разводят в многолуночных планшетах до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только 1 клетку. Затем супернатант в каждой лунке можно проверить на наличие желаемого антитела. Поскольку антитела в лунке продуцируются одной и той же В-клеткой, они будут направлены на один и тот же эпитоп и известны как моноклональные антитела .

Производство моноклональных антител было впервые изобретено Сезаром Мильштейном и Жоржем Дж. Ф. Келером , что принесло им Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1984 года, разделенную с Нильсом Кай Йерне .

использованная литература