Трансформация (генетика) - Transformation (genetics)

На этом изображении ген из бактериальной клетки 1 перемещается в бактериальную клетку 2. Этот процесс поглощения новым генетическим материалом бактериальной клетки 2 называется трансформацией.

В области молекулярной биологии и генетике , преобразование является генетическим изменением в клетку в результате прямого поглощения и включения экзогенного генетического материала от его окружения через клеточную мембрану (S). Для того чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна быть в состоянии компетентности , что может происходить в природе как ограниченная по времени реакция на условия окружающей среды, такие как голодание и плотность клеток, а также может быть индуцирована в лаборатории.

Трансформация - это один из трех процессов горизонтального переноса генов , в котором экзогенный генетический материал переходит от одной бактерии к другой, причем два других представляют собой конъюгацию (перенос генетического материала между двумя бактериальными клетками в прямом контакте) и трансдукцию (инъекцию чужеродной ДНК с помощью вирус бактериофага в бактерию-хозяин). При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.

По состоянию на 2014 год было известно около 80 видов бактерий, способных к трансформации, примерно поровну разделенных между грамположительными и грамотрицательными бактериями ; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты поддерживаются отдельными документами.

«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к животным клеткам, указывающее на прогрессирование до ракового состояния, этот процесс обычно называют « трансфекцией ».

История

Трансформация бактерий была впервые продемонстрирована в 1928 году британским бактериологом Фредериком Гриффитом . Гриффита интересовало, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей от пневмонии. Однако он обнаружил, что невирулентный штамм Streptococcus pneumoniae может стать вирулентным после воздействия убитых нагреванием вирулентных штаммов. Гриффит предположил, что некий « принцип преобразования » убитого нагреванием штамма был ответственен за то, что безвредный штамм стал вирулентным. В 1944 году Освальд Эйвери , Колин МакЛауд и Маклин Маккарти идентифицировали этот «трансформирующий принцип» как генетический . Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и, используя именно эту ДНК, смогли сделать безвредный штамм вирулентным. Они назвали это поглощение и включение ДНК бактериями «трансформацией» (см. Эксперимент Эйвери-МакЛеода-Маккарти ). Результаты экспериментов Эйвери и др. Сначала были скептически восприняты научным сообществом, и только после того, как были разработаны генетические методы. маркеры и открытие других методов генетической передачи ( конъюгация в 1947 году и трансдукция в 1953 году) Джошуа Ледербергом, что эксперименты Эйвери были приняты.

Первоначально считалось, что Escherichia coli , широко используемый лабораторный организм, невосприимчив к трансформации. Однако в 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что E. coli может быть индуцирована для поглощения ДНК бактериофага λ без использования фага-помощника после обработки раствором хлорида кальция. Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн , Энни Чанг и Лесли Хсу показали, что CaCl
₂лечение также эффективно для трансформации плазмидной ДНК. Метод трансформации Манделя и Хиги был позже усовершенствован Дугласом Ханаханом . Открытие искусственно индуцированной компетентности у E. coli создало эффективную и удобную процедуру трансформации бактерий, которая позволяет применять более простые методы молекулярного клонирования в биотехнологии и исследованиях , и теперь это рутинно используемая лабораторная процедура.

Трансформация с использованием электропорации была разработана в конце 1980-х годов, повысив эффективность трансформации in vitro и увеличив количество бактериальных штаммов, которые можно было трансформировать. Трансформация клеток животных и растений была также исследована с помощью первой трансгенной мыши , созданной путем инъекции гена гормона роста крысы в ​​эмбрион мыши в 1982 году. В 1897 году была обнаружена бактерия Agrobacterium tumefaciens , вызывающая опухоли растений, и в раннем возрасте. В 1970-х было обнаружено, что агент, вызывающий опухоль, представляет собой плазмиду ДНК, названную плазмидой Ti . Удалив гены в плазмиде, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений. Не все клетки растений восприимчивы к заражению A. tumefaciens , поэтому были разработаны другие методы, включая электропорацию и микроинъекцию . Бомбардировка частицами стала возможной с изобретением Джоном Сэнфордом системы доставки биологических частиц (генная пушка) в 1980-х годах.

Определения

Трансформация - это одна из трех форм горизонтального переноса генов, которые происходят в природе среди бактерий, при которой ДНК, кодирующая признак, переходит от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента путем гомологичной рекомбинации ; два других - это трансдукция , осуществляемая с помощью бактериофага , и конъюгация , при которой ген передается через прямой контакт между бактериями. При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.

Компетенция относится к временному состоянию способности принимать экзогенную ДНК из окружающей среды; это может быть вызвано в лаборатории.

Похоже, что это древний процесс, унаследованный от общего прокариотического предка, который является полезной адаптацией для содействия рекомбинационной репарации повреждений ДНК, особенно повреждений, приобретенных в стрессовых условиях. Естественная генетическая трансформация, по-видимому, является адаптацией к восстановлению повреждений ДНК, что также порождает генетическое разнообразие .

Трансформация была изучена у важных с медицинской точки зрения видов грамотрицательных бактерий, таких как Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae и Vibrio cholerae . Он также был изучен на грамотрицательных видах, обнаруженных в почве, таких как Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , и на грамотрицательных патогенах растений, таких как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa . Трансформация грамположительных бактерий изучалась у важных с медицинской точки зрения видов, таких как Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus и Streptococcus sanguinis, а также у грамположительных почвенных бактерий Bacillus subtilis . Также сообщалось о по крайней мере 30 видах Proteobacteria, распределенных в классах альфа, бета, гамма и эпсилон . Наиболее изученными протеобактериями в отношении трансформации являются важные с медицинской точки зрения патогены человека Neisseria gonorrhoeae (класс бета), Haemophilus influenzae (класс гамма) и Helicobacter pylori (класс эпсилон).

«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к животным клеткам, указывающее на прогрессирование до ракового состояния, этот процесс обычно называют « трансфекцией ».

Естественная компетентность и трансформация

По состоянию на 2014 год было известно около 80 видов бактерий, способных к трансформации, примерно поровну разделенных между грамположительными и грамотрицательными бактериями ; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты поддерживаются отдельными документами.

Естественно компетентные бактерии несут наборы генов, которые обеспечивают белковый аппарат для переноса ДНК через клеточную мембрану (мембраны). Перенос экзогенной ДНК в клетки может потребовать белки, которые участвуют в сборке IV пилей типа и II тип системы секреции , а также ДНК - транслоказной комплекс на цитоплазматической мембране.

Из-за различий в структуре клеточной оболочки грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют некоторые различия в механизмах захвата ДНК этими клетками, однако большинство из них имеют общие черты, связанные с родственными белками. ДНК сначала связывается с поверхностью компетентных клеток на рецепторе ДНК и проходит через цитоплазматическую мембрану через ДНК-транслоказу. Может проходить только одноцепочечная ДНК, при этом другая цепь разрушается нуклеазами. Затем транслоцированная одноцепочечная ДНК может быть интегрирована в бактериальные хромосомы с помощью RecA- зависимого процесса. В грамотрицательных клетках из-за наличия дополнительной мембраны ДНК требует наличия канала, образованного секретинами на внешней мембране. Пилин может потребоваться для компетентности, но его роль неясна. Поглощение ДНК обычно неспецифично для последовательности, хотя у некоторых видов присутствие конкретных последовательностей захвата ДНК может способствовать эффективному захвату ДНК.

Естественная трансформация

Естественная трансформация - это бактериальная адаптация к переносу ДНК, которая зависит от экспрессии многочисленных бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, ответственны за этот процесс. В целом трансформация - сложный, энергоемкий процесс развития. Чтобы бактерия могла связывать, захватывать и рекомбинировать экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна стать компетентной, то есть войти в особое физиологическое состояние. Для развития компетенции Bacillus subtilis требуется экспрессия около 40 генов. ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но за редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и, таким образом, гомологична резидентной хромосоме.

У B. subtilis длина перенесенной ДНК превышает 1271 т.п.н. (более 1 миллиона оснований). Переносимая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети общей длины хромосомы в 4215 т.п.н. Похоже, что около 7-9% реципиентных клеток занимают целую хромосому.

Способность к естественной трансформации проявляется у ряда прокариот, и на сегодняшний день известно, что 67 видов прокариот (в семи различных типах) подвергаются этому процессу.

Компетентность к трансформации обычно индуцируется высокой плотностью клеток и / или ограничением питания, условиями, связанными с стационарной фазой роста бактерий. Трансформация Haemophilus influenzae наиболее эффективно происходит в конце экспоненциального роста, когда рост бактерий приближается к стационарной фазе. Трансформация Streptococcus mutans , как и многих других стрептококков, происходит при высокой плотности клеток и связана с образованием биопленок . Компетентность B. subtilis индуцируется к концу логарифмического роста, особенно в условиях ограничения аминокислот. Точно так же у Micrococcus luteus (представителя менее изученного типа Actinobacteria ) компетентность развивается во время средне-поздней фазы экспоненциального роста, а также запускается из-за нехватки аминокислот.

Считается, что путем высвобождения интактной ДНК хозяина и плазмиды определенные бактериофаги вносят вклад в трансформацию.

Трансформация как адаптация к репарации ДНК

Компетентность специфически индуцируется условиями повреждения ДНК. Например, в Streptococcus pneumoniae трансформация индуцируется повреждающими ДНК агентами митомицином С (агент, сшивающий ДНК) и фторхинолоном (ингибитор топоизомеразы, вызывающий двухцепочечные разрывы). У B. subtilis трансформация усиливается УФ-светом, агентом, повреждающим ДНК. У Helicobacter pylori ципрофлоксацин, который взаимодействует с ДНК-гиразой и вводит двухцепочечные разрывы, индуцирует экспрессию генов компетентности, тем самым увеличивая частоту трансформации с использованием Legionella pneumophila , Charpentier et al. проверили 64 токсичных молекулы, чтобы определить, какие из них вызывают компетентность. Из них только шесть, все агенты, повреждающие ДНК, вызывали сильную индукцию. Этими агентами, повреждающими ДНК, были митомицин С (который вызывает межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксовая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, которые вызывают двухцепочечные разрывы), бицикломицин (вызывает одно- и двухцепочечные разрывы) и гидроксимочевина. (вызывает окисление оснований ДНК). УФ-свет также стимулировал компетентность L. pneumophila . Charpentier et al. предположили, что способность к трансформации, вероятно, возникла как реакция на повреждение ДНК.

Логарифмически растущие бактерии отличаются от бактерий в стационарной фазе количеством копий генома, присутствующих в клетке, и это имеет значение для способности выполнять важный процесс репарации ДНК . Во время логарифмического роста в бактериальной клетке могут присутствовать две или более копий любой конкретной области хромосомы, поскольку деление клетки не точно совпадает с репликацией хромосомы. Процесс гомологичной рекомбинационной репарации (HRR) - это ключевой процесс репарации ДНК, который особенно эффективен для восстановления двухцепочечных повреждений, таких как двухцепочечные разрывы. Этот процесс зависит от второй гомологичной хромосомы в дополнение к поврежденной хромосоме. Во время логарифмического роста повреждение ДНК в одной хромосоме может быть восстановлено с помощью HRR с использованием информации о последовательности из другой гомологичной хромосомы. Однако, когда клетки приближаются к стационарной фазе, они обычно имеют только одну копию хромосомы, и HRR требует ввода гомологичной матрицы извне клетки путем трансформации.

Чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации репарацией повреждений ДНК, была проведена серия экспериментов с использованием B. subtilis, облученного УФ-светом, в качестве повреждающего агента (обзор Michod et al. И Bernstein et al.). эксперименты показали, что трансформация ДНК действует для восстановления потенциально летальных повреждений ДНК, вызванных УФ-светом в ДНК реципиента. Конкретный процесс, ответственный за ремонт, вероятно, был HRR. Трансформацию у бактерий можно рассматривать как примитивный половой процесс, поскольку он включает взаимодействие гомологичной ДНК двух индивидуумов с образованием рекомбинантной ДНК, которая передается последующим поколениям. Бактериальная трансформация прокариот могла быть наследственным процессом, который привел к мейотическому половому размножению у эукариот (см. Эволюция полового размножения ; Мейоз ).

Методы и механизмы трансформации в лаборатории

Схема бактериальной трансформации - для которой сначала необходимо вызвать искусственную компетентность.

Бактериальный

Искусственная компетентность может быть вызвана лабораторными процедурами, которые включают создание пассивной проницаемости клетки для ДНК путем воздействия на нее условий, которые обычно не встречаются в природе. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ) в холодных условиях, перед тем, как подвергнуть их воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяин. Клетки, способные принимать ДНК, называются компетентными клетками.

Было обнаружено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ Mg снижает количество связей белок- липополисахарид за счет увеличения отношения ионных и ковалентных связей, что увеличивает текучесть мембран, облегчая трансформацию. Роль липополисахаридов здесь подтверждается наблюдением, что более короткие O-боковые цепи трансформируются более эффективно - возможно, из-за улучшенной доступности ДНК.

Поверхность бактерий, таких как E. coli, заряжена отрицательно из-за фосфолипидов и липополисахаридов на ее клеточной поверхности, а ДНК также заряжена отрицательно. Таким образом, одна из функций двухвалентного катиона - экранировать заряды, координируя фосфатные группы и другие отрицательные заряды, тем самым позволяя молекуле ДНК прилипать к поверхности клетки.

Проникновение ДНК в клетки E. coli осуществляется через каналы, известные как зоны адгезии или соединения Байера, при этом типичная клетка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда было обнаружено, что кобаламин (который также использует эти каналы) конкурентно ингибирует захват ДНК. Другой тип канала, участвующего в захвате ДНК, состоит из поли (HB): поли P: Ca. Предполагается, что поли (HB) оборачивается вокруг ДНК (которая сама по себе является полифосфатом) и находится в щите, образованном ионами Са.

Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодных условиях может также изменить или ослабить структуру поверхности клетки, делая ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс на клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.

Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергаются воздействию электрического поля 10-20 кВ / см, которое, как считается, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После электрического шока отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембраны клетки.

Дрожжи

Большинство видов дрожжей , включая Saccharomyces cerevisiae , могут трансформироваться экзогенной ДНК в окружающей среде. Было разработано несколько методов, облегчающих это преобразование с высокой частотой в лаборатории.

• Клетки дрожжей можно обрабатывать ферментами для разрушения их клеточных стенок с образованием сферопластов . Эти клетки очень хрупкие, но очень быстро поглощают чужеродную ДНК.
• Воздействие на неповрежденные дрожжевые клетки щелочных катионов, таких как цезий или литий, позволяет клеткам поглощать плазмидную ДНК. Более поздние протоколы адаптировали этот метод трансформации с использованием ацетата лития , полиэтиленгликоля и одноцепочечной ДНК. В этих протоколах одноцепочечная ДНК предпочтительно связывается со стенкой дрожжевых клеток, предотвращая это от плазмидной ДНК и оставляя ее доступной для трансформации.
• Электропорация : образование временных дырок в клеточных мембранах с помощью электрического шока; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.
• Ферментативное расщепление или перемешивание стеклянными шариками также можно использовать для трансформации дрожжевых клеток.

Эффективность - разные роды и виды дрожжей поглощают чужеродную ДНК с разной эффективностью. Кроме того, большинство протоколов трансформации было разработано для пекарских дрожжей S. cerevisiae и, следовательно, не может быть оптимальным для других видов. Даже в пределах одного вида разные штаммы обладают разной эффективностью трансформации, иногда различающейся на три порядка. Например, когда штаммы S. cerevisiae трансформировали 10 мкг плазмиды YEp13, штамм DKD-5D-H давал от 550 до 3115 колоний, тогда как штамм OS1 давал менее пяти колоний.

Растения

Доступен ряд методов для переноса ДНК в клетки растений. Некоторые векторные методы:

• Трансформация, опосредованная Agrobacterium, является самой простой и простой трансформацией растений. Ткань растений (часто листья) разрезают на мелкие кусочки, например, 10х10 мм, и вымачивают на десять минут в жидкости, содержащей суспендированные агробактерии . Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным при разрезе. Клетки растений выделяют связанные с раной фенольные соединения, которые, в свою очередь, действуют, повышая уровень вирулентности оперона Agrobacterium. Оперон вирулентности включает в себя множество генов, которые кодируют белки, которые являются частью системы секреции типа IV, которая экспортируется из белков и ДНК бактерий (обозначенных специфическими мотивами распознавания, называемыми пограничными последовательностями, и вырезанных в виде единой цепи из плазмиды вирулентности) в растение. клетка через структуру, называемую пилусом. Перенесенная ДНК (называемая Т-ДНК) направляется в ядро ​​растительной клетки с помощью сигналов ядерной локализации, присутствующих в белке VirD2 Agrobacterium, который ковалентно прикреплен к концу Т-ДНК на правой границе (RB). То, как именно Т-ДНК интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина, является активной областью исследований биологии растений. Предполагая, что маркер селекции (такой как ген устойчивости к антибиотикам) был включен в Т-ДНК, трансформированную ткань растения можно культивировать на селективных средах для получения побегов. Затем побеги переносят в другую среду, чтобы способствовать формированию корней. Как только корни трансгенного побега начинают расти, растения можно переносить в почву для завершения нормального жизненного цикла (создания семян). Семена этого первого растения (называемого Т1, для первого трансгенного поколения) могут быть посажены на селективном (содержащем антибиотик), или, если был использован ген устойчивости к гербицидам, в качестве альтернативы могут быть посажены в почву, а затем обработаны гербицидом для убить сегрегантов дикого типа. Некоторые виды растений, такие как Arabidopsis thaliana, могут быть трансформированы путем погружения цветов или всего растения в суспензию Agrobacterium tumefaciens , обычно штамма C58 (C = Cherry, 58 = 1958, год, в котором этот конкретный штамм A. tumefaciens был выращен. изолирован от вишневого дерева в саду Корнельского университета в Итаке, Нью-Йорк). Хотя многие растения остаются невосприимчивыми к трансформации этим методом, продолжаются исследования, которые продолжают добавлять в список виды, которые были успешно модифицированы таким способом.
• Вирусная трансформация ( трансдукция ): упакуйте желаемый генетический материал в подходящий растительный вирус и позвольте этому модифицированному вирусу заразить растение. Если генетический материал представляет собой ДНК, он может рекомбинировать с хромосомами с образованием трансформантных клеток. Однако геномы большинства вирусов растений состоят из одноцепочечной РНК, которая реплицируется в цитоплазме инфицированной клетки. Для таких геномов этот метод является формой трансфекции, а не настоящей трансформацией, поскольку встроенные гены никогда не достигают ядра клетки и не интегрируются в геном хозяина. Потомство инфицированных растений не содержит вирусов и встроенного гена.

Некоторые безвекторные методы включают:

• Генная пушка : также называется бомбардировкой частицами, бомбардировкой микрочастицами или биолистикой. Частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем попадают в молодые клетки растений или зародыши растений. Некоторый генетический материал останется в клетках и трансформирует их. Этот метод также позволяет трансформировать пластиды растений. Эффективность трансформации ниже , чем в Agrobacterium опосредованной трансформации, но большинство растений могут быть трансформированы с помощью этого метода.
• Электропорация : формирование переходных отверстий в клеточных мембранах с помощью электрических импульсов высокой напряженности поля; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.

Грибы

Есть несколько методов получения трансгенных грибов, большинство из которых аналогичны тем, которые используются для выращивания растений. Однако к грибам нужно относиться по-другому из-за некоторых их микроскопических и биохимических особенностей:

• Основной проблемой является дикариотическое состояние , в котором находятся части некоторых грибов; дикариотические клетки содержат два гаплоидных ядра, по одному от каждого родительского гриба. Если трансформируется только одно из них, что является правилом, процент трансформированных ядер уменьшается после каждой споруляции .
• Стенки грибковых клеток довольно толстые, что препятствует захвату ДНК, поэтому часто требуется (частичное) удаление; полная деградация, которая иногда необходима, дает протопласты .
• Мицелийные грибы состоят из нитчатых гиф , которые, если вообще разделены внутренними клеточными стенками, прерванными порами, достаточно большими, чтобы питательные вещества и органеллы, иногда даже ядра, могли проходить через каждую гифу. В результате отдельные клетки обычно не могут быть разделены. Это проблематично, поскольку соседние трансформированные клетки могут сделать нетрансформированные клетки невосприимчивыми к селективным обработкам, например, путем доставки питательных веществ или белков для устойчивости к антибиотикам.
• Кроме того, рост (и, следовательно, митоз) этих грибов происходит исключительно на кончике их гиф, что также может вызывать проблемы.

Как указывалось ранее, ряд методов, используемых для трансформации растений, также работает с грибами:

• Agrobacterium способны заражать не только растения, но и грибы, однако, в отличие от растений, грибы не выделяют фенольные соединения, необходимые для запуска Agrobacterium, поэтому их необходимо добавлять, например, в форме ацетосирингона .
• Благодаря развитию системы экспрессии малых РНК в грибах стало возможным внедрение CRISPR / CAS9-системы в клетки грибов. В 2016 году Министерство сельского хозяйства США объявило, что не будет регулировать штамм белого шампиньона, отредактированный с помощью CRISPR / CAS9, чтобы предотвратить потемнение плодовых тел, вызвав широкую дискуссию о размещении на рынке культур с редактированием CRISPR / CAS9.
• Физические методы, такие как электропорация, биолистика («генная пушка»), сонопорация, в которой используется кавитация пузырьков газа, производимых ультразвуком для проникновения через клеточную мембрану, и т. Д., Также применимы к грибам.

Животные

Введение ДНК в клетки животных принято называть трансфекцией и обсуждается в соответствующей статье.

Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии

Открытие искусственно индуцированной компетентности у бактерий позволяет использовать такие бактерии, как Escherichia coli , в качестве удобного хозяина для манипуляции с ДНК, а также для экспрессии белков. Обычно плазмиды используются для трансформации E. coli . Чтобы стабильно сохраняться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать точку начала репликации , которая позволяет ей реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки.

Эффективность, с которой компетентная культура может поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, известна как эффективность трансформации и измеряется в колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг используемой ДНК. Эффективность трансформации 1 × 10 ⁸ КОЕ / мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19 , примерно эквивалентна 1 на 2000 молекул трансформируемой плазмиды.

При трансформации хлоридом кальция клетки получают путем охлаждения клеток в присутствии Ca²⁺
(в CaCl
₂раствор), благодаря чему клетка становится проницаемой для плазмидной ДНК . Клетки инкубируют на льду с ДНК, а затем подвергают кратковременному тепловому шоку (например, при 42 ° C в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать от 10 ⁶ до 10 ⁷ трансформантов на микрограмм плазмиды; плохой препарат будет составлять около 10 ⁴ / мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~ 10 ⁸ колоний на микрограмм плазмиды. Однако существуют протоколы для создания суперкомпетентных клеток, которые могут давать эффективность трансформации более 10 ⁹ . Однако химический метод обычно не работает для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому, что природные экзонуклеазные ферменты клетки быстро разрушают линейную ДНК. Напротив, естественно компетентные клетки обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК.

Эффективность трансформации с использованием CaCl
₂Метод уменьшается с размером плазмиды, поэтому электропорация может быть более эффективным методом захвата большой плазмидной ДНК. Клетки, используемые в электропорации, должны быть подготовлены сначала промывкой в ​​холодной бидистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые могут создавать искры во время процесса электропорации.

Отбор и скрининг при трансформации плазмид

Поскольку трансформация обычно дает смесь относительно небольшого числа трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходим метод отбора клеток, которые приобрели плазмиду. Следовательно, плазмида требует селектируемого маркера , чтобы клетки без плазмиды могли быть убиты или их рост был остановлен. Устойчивость к антибиотикам - наиболее часто используемый маркер прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику, к которому бактерии в остальном чувствительны. Смесь обработанных клеток культивируют на среде, содержащей антибиотик, так что только трансформированные клетки могут расти. Другой метод отбора - использование определенных ауксотрофных маркеров, которые могут компенсировать неспособность метаболизировать определенные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования подходящих мутированных штаммов, которые недостаточны для синтеза или использования конкретной биомолекулы, и трансформированные клетки культивируют в среде, которая позволяет расти только клеткам, содержащим плазмиду.

В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таком эксперименте не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Следовательно, могут быть использованы дополнительные методы для скрининга трансформированных клеток, содержащих плазмиду со вставкой. Репортерные гены можно использовать в качестве маркеров , таких как ген lacZ , который кодирует β-галактозидазу, используемую в сине-белом скрининге . Этот метод скрининга основан на принципе α- комплементации , когда фрагмент гена lacZ ( lacZα ) в плазмиде может дополнять другой мутантный ген lacZ ( lacZΔM15 ) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержащая lacZ-α , трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить, когда клетки выращивают в чашках, содержащих X-gal , образуя характерные синие колонии. Однако сайт множественного клонирования , где представляющий интерес ген может быть лигирован в плазмидный вектор , находится внутри гена lacZα . Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα , и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, затем можно легко отличить по ее белой окраске от неудачных синих.

Другими широко используемыми репортерными генами являются зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, которые светятся зеленым в синем свете, и фермент люцифераза , который катализирует реакцию с люциферином для излучения света. Рекомбинантная ДНК также может быть обнаружена с использованием других методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с радиоактивным РНК-зондом, в то время как клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, также могут быть обнаружены с использованием иммунологических методов.

использованная литература

внешние ссылки

• Бактериальная трансформация (флэш-анимация)
• «Готовься, целься, стреляй!» В Институте молекулярной физиологии растений им. Макса Планка в Потсдаме-Голме растительные клетки подвергаются «бомбардировке» с помощью пистолета-распылителя.