Холлидей джанкшн - Holliday junction

Схема соединения Холлидея, показывающая последовательность оснований и вторичную структуру, но не третичную структуру . Показанная последовательность - лишь одна из многих возможностей. Это неподвижный перекресток Холлидея, потому что последовательности не симметричны.

Соединение Холлидея представляет собой разветвленную структуру нуклеиновой кислоты, которая содержит четыре двухцепочечных плеча, соединенных вместе. Эти рычаги могут принимать одно из нескольких конформаций в зависимости от буферных концентраций соли и последовательность из нуклеотидов , наиболее близких к переходу. Структура названа в честь Робина Холлидея , молекулярного биолога , предложившего ее существование в 1964 году.

В биологии соединения Холлидея являются ключевым промежуточным звеном во многих типах генетической рекомбинации , а также в репарации двухцепочечных разрывов . Эти соединения обычно имеют симметричную последовательность и, таким образом, подвижны, что означает, что четыре отдельных плеча могут скользить через соединение по определенной схеме, которая в значительной степени сохраняет спаривание оснований . Кроме того, в некоторых функциональных молекулах РНК появляются четырехлепестковые соединения, подобные соединениям Холлидея .

Неподвижные соединения Холлидея с асимметричными последовательностями, которые фиксируют нити в определенном положении, были искусственно созданы учеными для изучения их структуры в качестве модели естественных соединений Холлидея. Эти соединения также позже нашли применение в качестве основных структурных строительных блоков в нанотехнологиях ДНК , где несколько соединений Холлидея могут быть объединены в определенные геометрические формы, которые обеспечивают молекулам высокую степень структурной жесткости .

Состав

Молекулярная структура многослойного соединения Холлидея, в котором четыре плеча складываются в два двухспиральных домена. Обратите внимание, как синие и красные нити остаются примерно спиральными, а зеленые и желтые нити пересекаются между двумя доменами.
Молекулярная структура соединения Холлидея без стэка (open-X). В этой конформации отсутствует наложение оснований между двойными спиральными доменами, и она стабильна только в растворах, в которых отсутствуют ионы двухвалентных металлов, такие как Mg 2+ . Из PDB : 3CRX .
Схематические диаграммы трех конформационных изомеров со стэкингом оснований соединения Холлидея. Два уложенных друг на друга конформера различаются тем, какие наборы из двух плеч связаны коаксиальным стопкой : слева стопки красно-синие и голубо-пурпурные, а справа стопки красно-голубые и сине-пурпурные. Основания, ближайшие к точке соединения, определяют, какой сложенный изомер доминирует.

Соединения Холлидея могут существовать во множестве конформационных изомеров с различными паттернами коаксиального стэкинга между четырьмя двойными спиральными плечами. Коаксиальная укладка - это тенденция тупых концов нуклеиновых кислот связываться друг с другом за счет взаимодействий между открытыми основаниями. Есть три возможных конформера: неупакованная (или открытая-X) форма и две сложенные формы. Неупакованная форма доминирует в отсутствие двухвалентных катионов, таких как Mg 2+ , из-за электростатического отталкивания между отрицательно заряженными основными цепями нитей. В присутствии по меньшей мере около 0,1 м M Mg 2+ электростатическому отталкиванию противодействуют, и преобладают многослойные структуры. По состоянию на 2000 год не было достоверно известно, является ли электростатическое экранирование результатом сайт-специфического связывания катионов с переходом или присутствием диффузного скопления ионов в растворе.

Несложенная форма представляет собой почти квадратную плоскую вытянутую форму. С другой стороны, уложенные друг на друга конформеры имеют два непрерывных двухспиральных домена, разделенных углом примерно 60 ° в правом направлении. Две из четырех цепей остаются примерно спиральными, оставаясь внутри каждого из двух двойных спиральных доменов, в то время как другие две перекрещиваются между двумя доменами антипараллельным образом.

Две возможные штабелированные формы различаются тем, какие пары плеч сложены друг с другом; какая из двух доминирует, сильно зависит от последовательностей оснований, ближайших к соединению. Некоторые последовательности приводят к равновесию между двумя конформерами, в то время как другие сильно предпочитают единственный конформер. В частности, соединения, содержащие последовательность A-CC, соединяющую точку соединения, по-видимому, сильно предпочитают конформер, который позволяет образовывать водородную связь между вторым цитозином и одним из фосфатов в точке соединения. В то время как большинство исследований было сосредоточено на идентичности четырех оснований, ближайших к стыку на каждом плече, очевидно, что более удаленные основания также могут влиять на наблюдаемые конформации стэкинга.

В соединениях с симметричными последовательностями точка ветвления является мобильной и может перемещаться в процессе случайного блуждания . Скорость миграции ответвлений сильно зависит от концентрации ионов, при этом время одного шага увеличивается от 0,3-0,4 мс при отсутствии ионов до 270-300 мс при 10 мМ Mg 2+ . Изменение скорости коррелирует с формированием уложенных друг на друга структур по сравнению с разложенными.

Соединения Холлидея с зазубриной или разрывом в одной из нитей в точке соединения принимают перпендикулярную ориентацию и всегда предпочитают конформер штабелирования, который размещает зарубку на перекрестной нити, а не в спиральной нити.

Соединения Холлидея РНК принимают антипараллельную стопку конформацию при высоких концентрациях магния, перпендикулярную стопку конформацию при умеренных концентрациях и вращаются в параллельную стопку конформацию при низких концентрациях, в то время как даже небольшие концентрации ионов кальция благоприятствуют антипараллельному конформеру.

Биологическая функция

Два пути гомологичной рекомбинации у эукариот , демонстрирующие образование и разрешение соединений Холлидея.

Соединение Холлидея является ключевым промежуточным звеном в гомологичной рекомбинации , биологическом процессе, который увеличивает генетическое разнообразие за счет смещения генов между двумя хромосомами , а также событий сайт-специфической рекомбинации с участием интеграз . Они дополнительно участвуют в ремонте двухцепочечных разрывов . Кроме того, крестообразные структуры, включающие соединения Холлидея, могут возникать для снятия спиральной деформации в симметричных последовательностях суперспиралей ДНК . В то время как четыре рычага спаи также появляются в функциональном РНКЕ молекулах, такие как U1 spliceosomal РНК и шпилька рибозима из вируса табачной кольцевой пятнистости , они обычно содержат неспаренный нуклеотид между парным двуспиральными доменами, и , таким образом , строго говоря , не принимают структуру Holliday .

Соединения Холлидея при гомологичной рекомбинации находятся между идентичными или почти идентичными последовательностями, что приводит к симметричному расположению последовательностей вокруг центрального соединения. Это позволяет процессу миграции ветвей происходить там, где пряди перемещаются через точку соединения. Расщепление или разрешение соединения Холлидея может происходить двумя способами. Расщепление исходного набора цепей приводит к двум молекулам, которые могут показывать конверсию генов, но не хромосомный кроссовер , в то время как расщепление другого набора двух цепей вызывает кроссовер в результирующих рекомбинантных молекулах. Все продукты, независимо от расщепления, представляют собой гетеродуплексы в области миграции соединений Холлидея.

Многие белки способны распознавать или искажать структуру соединения Холлидея. Один из таких классов содержит ферменты , разрешающие соединения, которые расщепляют соединения, иногда специфическим для последовательности образом. Такие белки по-разному искажают структуру соединения, часто приводя соединение к разложенной конформации, разрывая центральные пары оснований и / или изменяя углы между четырьмя плечами. К другим классам относятся белки миграции ветвей, которые на порядки увеличивают скорость обмена, и сайт-специфические рекомбиназы . У прокариот резольвазы соединения Холлидея делятся на два семейства, интегразы и нуклеазы, каждое из которых структурно сходно, хотя их последовательности не консервативны.

У эукариот двумя основными моделями того, как гомологичная рекомбинация восстанавливает двухцепочечные разрывы в ДНК, являются путь репарации двухцепочечных разрывов (DSBR) (иногда называемый моделью двойного соединения Холлидея ) и путь отжига зависимых цепей (SDSA). В случае двухцепочечного разрыва 3'-конец разрушается, а более длинный 5'-конец вторгается в смежную сестринскую хроматиду, образуя репликационный пузырь. Когда этот пузырь приближается к разорванной ДНК, более длинная 5 'антисмысловая цепь снова вторгается в смысловую цепь этой части ДНК, транскрибируя вторую копию. Когда репликация заканчивается, оба хвоста повторно соединяются с образованием двух соединений Холлидея, которые затем расщепляются белками по разным образцам. Анимацию этого процесса можно увидеть здесь .

Двухцепочечные разрывы ДНК у бактерий восстанавливаются путем гомологичной рекомбинации RecBCD . Считается, что разрывы, которые происходят только на одной из двух цепей ДНК, известные как одноцепочечные разрывы, восстанавливаются путем RecF . Оба пути RecBCD и RecF включают серию реакций, известных как миграция ветвей , в которой отдельные нити ДНК обмениваются между двумя пересекающимися молекулами дуплексной ДНК, и разрешение , в котором эти две пересекающиеся молекулы ДНК разделяются и восстанавливаются до их нормального состояния. двухцепочечное состояние. Гомологичная рекомбинация происходит у нескольких групп вирусов. В ДНК-вирусах, таких как герпесвирус , рекомбинация происходит по механизму разрыва и повторного соединения, как у бактерий и эукариот. У бактерий миграции ветвей способствует комплекс RuvABC или белок RecG , молекулярные моторы, которые используют энергию гидролиза АТФ для перемещения соединения. Затем соединение необходимо разделить на два отдельных дуплекса, восстановив либо родительскую конфигурацию, либо перекрестную конфигурацию. Разделение может происходить либо горизонтально, либо вертикально во время гомологичной рекомбинации, давая продукты-заплатки (если они находятся в той же ориентации во время ремонта двухцепочечного разрыва) или продукты сращивания (если в разных ориентациях во время восстановления двухцепочечного разрыва). RuvA и RuvB представляют собой белки миграции ветвей, а RuvC - фермент, разрешающий соединения.

Имеются данные о рекомбинации некоторых РНК-вирусов , в частности вирусов с положительным смыслом ssRNA, таких как ретровирусы , пикорнавирусы и коронавирусы . Существуют разногласия по поводу того, происходит ли гомологичная рекомбинация в вирусах с отрицательным значением ssRNA, таких как грипп .

разрешение

У почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae , соединения Холлидея могут разрешаться четырьмя разными путями, которые составляют по существу все разрешение соединений Холлидея in vivo . Путь, который вызывает большинство кроссоверов у почкующихся дрожжей S. cerevisiae и, возможно, у млекопитающих, включает белки EXO1 , гетеродимер MLH1 - MLH3 (называемый MutL гамма) и SGS1 (ортолог геликазы синдрома Блума ). Гетеродимер MLH1-MLH3 связывается преимущественно с соединениями Холлидея. Это эндонуклеаза, которая делает одноцепочечные разрывы в суперспиральной двухцепочечной ДНК. Гетеродимер MLH1-MLH3 способствует образованию кроссоверных рекомбинантов . В то время как другие три пути, включая белки MUS81 -MMS4, SLX1 и YEN1, соответственно, может способствовать разрешение перехода Холлидей в естественных условиях, отсутствие всех трех нуклеаз имеет только умеренное влияние на формирование перекрестных продуктов.

Двойные мутанты, удаленные как для MLH3 (основной путь), так и для MMS4 (второстепенный путь), показали резко сниженный кроссинговер по сравнению с мутантами дикого типа (в 6-17 раз); однако жизнеспособность спор была достаточно высокой (62%), а расхождение хромосом оказалось в основном функциональным.

Хотя MUS81 является компонентом минорного пути кроссовера в мейозе почкующихся дрожжей, растений и позвоночных, у простейших Tetrahymena thermophila MUS81, по-видимому, является частью важного, если не преобладающего пути кроссовера. Путь MUS81 также, по-видимому, является преобладающим перекрестным путем у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe .

В MSH4 и MSH5 белки образуют гетероциклическое-олигомерные структуры (гетеродимера) у дрожжей и человека. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae MSH4 и MSH5 действуют специфически, способствуя кроссоверам между гомологичными хромосомами во время мейоза. Комплекс MSH4 / MSH5 связывает и стабилизирует двойные соединения Холлидея и способствует их разделению в продукты кроссовера. Гипоморфный (частично функциональный) мутант S. cerevisiae MSH4 показал 30% -ное снижение числа кроссоверов по всему геному и большое количество мейозов с необменными хромосомами. Тем не менее, этот мутант дал начало паттернам жизнеспособности спор, предполагающим, что сегрегация необменных хромосом происходит эффективно. Таким образом, у S. cerevisiae собственное сегрегация, по-видимому, не полностью зависит от кроссоверов между гомологичными парами.

Использование в ДНК-нанотехнологиях

Этот супрамолекулярный комплекс с двойным кроссовером (DX) содержит два соединения Холлидея между двумя двойными спиральными доменами, вверху и внизу на этом изображении. Эта плитка способна образовывать двумерные массивы.
Основная статья: ДНК-нанотехнологии

ДНК-нанотехнология - это разработка и производство искусственных структур нуклеиновых кислот в качестве инженерных материалов для нанотехнологий, а не в качестве носителей генетической информации в живых клетках. Эта область использует разветвленные структуры ДНК в качестве основных компонентов для создания более сложных, рационально спроектированных структур. Таким образом, соединения Холлидея являются компонентами многих таких структур ДНК. Поскольку изолированные комплексы соединений Холлидея слишком гибки, чтобы собираться в большие упорядоченные массивы, структурные мотивы с множественными соединениями Холлидея используются для создания жестких « плиток », которые затем могут собираться в более крупные «массивы».

Диаграммы комплекса треугольника тенсегрити, содержащего три контакта Холлидея, как изолированно (а), так и как часть кристалла (б, в). В дополнение к показанному двумерному массиву эта структура способна формировать трехмерные кристаллы.

Наиболее распространенным таким мотивом является комплекс двойного кроссовера (DX), который содержит два соединения Холлидея в непосредственной близости друг от друга, что приводит к жесткой структуре, которая может самособираться в более крупные массивы. Структура молекулы DX вынуждает соединения Холлидея принимать конформацию с двухспиральными доменами, расположенными непосредственно бок о бок, в отличие от их предпочтительного угла около 60 °. Комплекс может быть спроектирован так, чтобы обеспечить параллельную или антипараллельную ориентацию соединений, но на практике антипараллельная разновидность ведет себя более хорошо, а параллельная версия используется редко.

Структурный мотив DX является фундаментальным строительным блоком метода ДНК-оригами , который используется для создания более крупных двух- и трехмерных структур произвольной формы. Вместо использования отдельных плиток DX одну длинную прядь каркаса складывают в желаемую форму с помощью нескольких коротких прядей. При сборке нить каркаса является непрерывной через двойные спиральные домены, в то время как нити скобки участвуют в соединениях Холлидея как перекрестные нити.

Были продемонстрированы некоторые типы плитки, которые сохраняют естественный угол перекрестка Холлидей 60 °. В одном из таких массивов используются плитки, содержащие четыре перекрестка Холлидея в виде параллелограмма. Эта структура имела то преимущество, что позволяла непосредственно визуализировать угол перехода с помощью атомно-силовой микроскопии . Плитки из трех переходов Холлидея в виде треугольника были использованы для создания периодических трехмерных массивов для использования в рентгеновской кристаллографии биомолекул. Эти структуры названы из-за их сходства со структурными единицами, основанными на принципе тенсегрити , в котором элементы используются как при растяжении, так и при сжатии.

История

Робин Холлидей предложил структуру соединения, которая теперь носит его имя, как часть своей модели гомологичной рекомбинации в 1964 году, основываясь на своих исследованиях организмов Ustilago maydis и Saccharomyces cerevisiae . Модель предоставила молекулярный механизм, объясняющий как генную конверсию, так и хромосомный кроссовер . Холлидей понял, что предложенный путь будет создавать сегменты гетеродуплексной ДНК с несоответствием оснований между различными версиями одного гена. Он предсказал, что у клетки будет механизм восстановления несоответствия, который позже был обнаружен. До модели Холлидея принятая модель включала механизм выбора копии, при котором новая цепь синтезируется непосредственно из частей различных родительских цепей.

В исходной модели Холлидея для гомологичной рекомбинации одноцепочечные разрывы происходят в одной и той же точке на одной цепи каждой родительской ДНК. Затем свободные концы каждой разорванной цепи перемещаются к другой спирали ДНК. Там вторгающиеся нити присоединяются к свободным концам, с которыми они сталкиваются, в результате чего образуется перекресток Холлидея. По мере того, как каждая перекрестная цепь повторно отжигается со своей исходной партнерской цепью, она вытесняет исходную дополнительную цепь впереди себя. Это заставляет соединение Холлидея мигрировать, создавая сегменты гетеродуплекса. В зависимости от того, какая цепь использовалась в качестве матрицы для репарации другой, четыре клетки, полученные в результате мейоза, могут иметь три копии одного аллеля и только одну из других вместо нормальных двух аллелей каждого, свойство, известное как преобразование генов. .

Исходная модель Холлидея предполагала, что гетеродуплексная ДНК будет присутствовать на обеих хромосомах, но экспериментальные данные о дрожжах опровергли это. Обновленная модель, разработанная Мэттом Мезельсоном и Чарли Рэддингом в 1975 году, представила идею миграции ветвей. Дальнейшие наблюдения в 1980-х годах привели к предложению альтернативных механизмов рекомбинации, таких как модель двухцепочечного разрыва ( Джек Шостак , Франк Шталь и другие) и модель одноцепочечного отжига. Третья, модель зависимого от синтеза отжига цепей, не включала соединения Холлидея.

Первое экспериментальное свидетельство структуры соединения Холлидея было получено в результате исследований с помощью электронной микроскопии в конце 1970-х годов, когда четырехлепестковая структура была четко видна на изображениях плазмидной и бактериофаговой ДНК. Позже, в 1980-х годах, были идентифицированы ферменты, ответственные за инициирование образования и связывание с соединениями Холлидея, хотя по состоянию на 2004 г. идентификация резольваз соединений Холлидея у млекопитающих оставалась неуловимой (тем не менее, см. Раздел «Разрешение соединений Холлидея» выше для получения дополнительной информации. последняя информация). В 1983 году Надриан Симан впервые сконструировал искусственные соединения Холлидея из синтетических олигонуклеотидов , что позволило более непосредственно изучить их физические свойства. Большая часть раннего анализа структуры соединений Холлидея была сделана на основе гель-электрофореза , FRET , а также исследований следов гидроксильных радикалов и нуклеаз . В 1990-е годы стали доступны методы кристаллографии и ЯМР нуклеиновых кислот , а также инструменты компьютерного молекулярного моделирования .

Первоначально генетики предполагали, что соединение примет параллельную, а не антипараллельную конформацию, потому что это приведет к более близкому выравниванию гомологичных дуплексов друг с другом. Химический анализ 1980-х годов показал, что соединение на самом деле предпочитает антипараллельную конформацию, открытие, которое считалось спорным, и сам Робин Холлидей поначалу сомневался в результатах. Позднее антипараллельная структура получила широкое признание благодаря данным рентгеновской кристаллографии молекул in vitro , хотя по состоянию на 2004 г. последствия для структуры in vivo оставались неясными, особенно структура соединений часто изменяется связанными с ней белками.

Концептуальные основы нанотехнологии ДНК были впервые заложены Надрианом Симаном в начале 1980-х годов. В то время был известен ряд естественных разветвленных структур ДНК, включая вилку репликации ДНК и мобильное соединение Холлидея, но, по мнению Симана, неподвижные соединения нуклеиновых кислот могут быть созданы путем правильного конструирования последовательностей цепей для удаления симметрии в собранной молекуле. и что эти неподвижные переходы в принципе могут быть объединены в жесткие кристаллические решетки. Первая теоретическая статья, предлагающая эту схему, была опубликована в 1982 году, а первая экспериментальная демонстрация неподвижного соединения ДНК была опубликована в следующем году. Симан разработал более жесткий мотив двойного кроссовера (DX) , подходящий для формирования двумерных решеток, продемонстрированный им и Эриком Винфри в 1998 году . В 2006 году Пол Ротемунд впервые продемонстрировал технику ДНК-оригами для простого и надежного создания свернутых структур ДНК произвольной формы. Этот метод позволил создать гораздо более крупные структуры, чем это было возможно ранее, и которые технически менее требовательны для проектирования и синтеза. Синтез трехмерной решетки был наконец опубликован Симаном в 2009 году, почти через тридцать лет после того, как он намеревался его реализовать.

использованная литература

внешние ссылки